Визуализация обесценения эндотелия и глиальных барьеров нервно-сосудистого подразделения во время Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит в естественных условиях
Summary
Здесь мы представляем протоколы для расследования ухудшение нервно-сосудистого подразделения во время Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит в естественных условиях. Мы конкретно рассмотреть способы определения проницаемости гематоэнцефалического барьера и gelatinase деятельности в лейкоцитарной миграции через глиальная мембрана.
Abstract
Нервно-сосудистого единицы (NVU) состоит из микрососудистой эндотелиальных клеток, образующих гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), эндотелиальные базальной мембраны с встроенный pericytes, и глиальная составе Паренхиматозный базальной мембраны и Астроцитарная конец канал охватывает аспект abluminal микрососудов центральной нервной системы (ЦНС). Помимо поддержания ЦНС гомеостаза NVU управляет людьми иммунных клеток в ЦНС. Во время immunosurveillance ЦНС низкое количество активированных лимфоцитов могут пересекать эндотелиальный барьер не вызывая BBB дисфункции или клинического заболевания. В отличие от этого во время neuroinflammation такие как рассеянный склероз или его животной модели Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) большое количество иммунных клеток могут пересекать BBB и впоследствии глиальная, в конечном счете достигая паренхимы ЦНС приводит к клинического заболевания. Миграция иммунных клеток в ЦНС паренхимы является таким образом двухэтапный процесс, который включает последовательные миграции через эндотелиальные и глиальных барьер NVU, используя собственный молекулярных механизмов. Если после их прохождения через эндотелиальный барьер, Т-клетки сталкиваются их родственных антигена на периваскулярной антиген представляющих клеток, их местные оживление будет инициировать последующих механизмов, ведущих к фокуса активации gelatinases, который позволят Т-клетки пересечь глиальных барьер и ввести ЦНС паренхимы. Таким образом оценки, BBB проницаемость и деятельность ММР в пространственной корреляции для накопления иммунных клеток в ЦНС при ЕАЕ позволяет указать потеря целостности эндотелия и глиальных барьеров NVU. Мы здесь показать, как вызвать ЕАЕ мышей C57BL/6, активная иммунизация и как впоследствии анализировать BBB проницаемости в естественных условиях, используя сочетание экзогенных Люминесцентные индикаторы. Мы также показать, как визуализировать и локализовать gelatinase активность в мозге ЕАЕ, на месте zymogaphy, в сочетании с immunofluorescent stainings BBB подвале мембран и CD45 + вторжение иммунных клеток.
Introduction
Центральной нервной системы (ЦНС) координирует все тело и психических функций в позвоночных, и имеет важное значение для надлежащей коммуникации нейронов ЦНС гомеостаза. CNS гомеостаза оправдывается блок нервно-сосудистых (NVU), который защищает ЦНС от меняющейся обстановке поток крови. NVU состоит из ЦНС микрососудистой эндотелиальных клеток, которые биохимически уникальны и создании гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) в непрерывная связь с pericytes, астроциты, нейроны и компонентов внеклеточного матрикса (ECM), создания двух собственный подвал мембраны1. Эндотелиальные базальной мембраны, ensheathes, abluminal аспект BBB эндотелиальных клеток укрывает большое количество pericytes и состоит из Ламинин α4 и α5 Ламинин, помимо других ECM белки2. В противоположность этому Паренхиматозный базальной мембраны состоит из Ламинин α1 и α2 Ламинин и обнял Астроцитарная конце-ноги. Паренхиматозный базальной мембраны вместе с конца ноги экзоцитоз сочиняет глиальная который сегрегирует ЦНС нейронной сети из спинномозговой жидкости заполнены периваскулярной или субарахноидального пространства3. Благодаря уникальной архитектуре NVU иммунных клеток в ЦНС отличается от что в периферических тканях как он требует двухэтапный процесс с иммунных клеток, сначала нарушение эндотелиальных BBB и впоследствии глиальная мембрана для того чтобы достигать ЦНС паренхимы.
Рассеянный склероз (РС) является распространенным заболеванием neuroinflammatory центральной нервной системы, в которой большое количество циркулирующих иммунных клеток введите ЦНС и вызвать neuroinflammation, демиелинизации и фокуса потеря целостности BBB4. Потеря целостности BBB является ранней отличительной чертой МС, как указано наличие контраст гадолиния повышения поражений ЦНС как визуализированное магнитно-резонансная томография (МРТ)5. Лейкоцитарные кровоподтек в ЦНС происходит на уровне postcapillary венул; Однако точные механизмы, участвующие в иммунных клеток диапедез через BBB базальной мембраны и впоследствии глиальных барьер по-прежнему быть изучены. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) служит животной модели для MS и внесла существенный вклад в наши текущие знания о патогенезе MS. Например с использованием модели ЕАЕ было обнаружено, что кровоподтек лейкоцитов происходит в многоэтапный процесс, включая первоначальный захват и подвижного шаг при посредничестве селектинов и молекулами муцина как например P селектина гликопротеина лиганда (PSGL) -1, следуют Интегрин зависимые фирмы арест и ползать Т-клеток на BBB эндотелиальных клеток разрешительной стороны для диапедез6.
После того, как Т-клетки пересекли эндотелиальных BBB и эндотелиальных базальной мембраны, они должны столкнуться их родственных антигена на макрофаги и дендритные клетки, стратегически локализованы в лептоменингеальных или периваскулярные пространства. Это взаимодействие индуцирует фокуса производства про воспалительных медиаторов, триггер, последующие механизмы, необходимые для вторжения ткани ЦНС иммунных клеток через глии limitans7,8,9. Фокуса Активация матрицы металлопротеиназ (СПП) -2 и MMP-9 изменяет хемокиновых активации и индуцирует Деградация внеклеточного матрикса рецепторов на конце экзоцитоз-ноги, которая является предпосылкой для иммунной клетки миграции через глиальная в Паренхима ЦНС и побудить появления клинических симптомов ЕАЕ10,11.
Сочетая обнаружения ЦНС, проникнув иммунных клеток с BBB утечки и gelatinase активность в разделах ткани ЦНС предоставляет ценную информацию о функциональной целостности эндотелия и глиальных барьера в контексте neuroinflammation. К примеру, мы недавно исследовали учредительного потеря эндотелиальной туго Джанкшен молекулы соединительной Межмицеллярная молекула (JAM)-B людьми иммунных клеток в ЦНС в контексте ЕАЕ. По сравнению с здоровых мышей C57BL/6 одичал типа, здоровый джем-B-недостаточным однопометники показал не нарушение целостности BBB как показано в естественных условиях проницаемость оценки с использованием как внутреннего, так и экзогенных Трейсеры12. В контексте ЕАЕ мышей C57BL/6 джем-B-недостаточным показали улучшенное болезни симптомы, который был связан с треппинга воспалительных клеток в лептоменингеальных и периваскулярные пространства12. Для изучения этого явления мы применили в situ Зимография, позволяя определение gelatinase активности для того чтобы проверить если отсутствие gelatinase активности в джем-B-недостаточным мышей может нести ответственность за снижение числа иммунных клеток способны нарушить глии limitans12.
Учитывая наличие различных генетически модифицированные мыши модели отсутствует, например, различные BBB жесткие соединения молекул, которые могут вызвать изменения в функции BBB, методологии для расследования BBB целостности имеют важное значение. Кроме того недавно разработанные препараты могут повлиять на NVU барьеров. Здесь мы покажем, как побудить ЕАЕ мышей C57BL/6 путем активной иммунизации с миелина Олигодендроциты гликопротеина (MOG)-пептидные aa35-55 в полной Фройнд адъювантов. Мы затем объяснить, как локализовать иммунных клеток инфильтрата через эндотелиальные и глиальных барьеры NVU и как учиться в естественных условиях эндотелия и глиальных барьер целостность, на месте обнаружения экзогенных Трейсеры и gelatinase деятельности, соответственно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем протокол стимулировать и контролировать ЕАЕ в самок мышей C57BL/6. Женщины преференциально выбраны, и число случаев заболевания женщин: мужчины 3:1 в мс. Для оценки тяжести ЕАЕ, мы сделали использовать 3-точка забил листа. ЕАЕ тяжести обычно забил в отношении серьезност…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы с благодарностью признаем Лидия Сорокин, который разделил ее оригинал в situ Зимография протокол10 с нами.
Materials
| AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
| Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
| Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
| Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
| Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
| Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
| Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
| EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
| Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
| Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
| Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
| microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
| NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
| Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
| poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
| repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
| sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
| syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
| syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |
Riferimenti
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
- Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
- Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
- Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
- Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscienze. , (2017).
- Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
- Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
- Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
- Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
- Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
- Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
- Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
- Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
- Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, (2007).
- Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
- Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis–a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
- Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
- Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
- Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
- Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
- Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
- Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
- Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
- Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
- Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
- Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).
