वीवो में प्रयोगात्मक Autoimmune Encephalomyelitis के दौरान न्यूरोवैस्कुलर यूनिट के Endothelial और Glial बाधाओं के Visualizing हानि
Summary
यहाँ, हम विवो में प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis के दौरान neurovascular इकाई की हानि की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल उपस्थित । हम विशेष रूप से पता कैसे रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता और जिलेटाइनसे glia लिमिटेंस भर में ल्यूकोसाइट प्रवास में शामिल गतिविधि का निर्धारण करने के लिए ।
Abstract
neurovascular इकाई (NVU) माइक्रोवास्कुलर endothelial रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB), एम्बेडेड pericytes के साथ एक endothelial तहखाने झिल्ली, और पैरेन्काइमल तहखाने झिल्ली और astrocytic द्वारा रचित glia लिमिटेंस बनाने कोशिकाओं से बना है केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) माइक्रोवेसल्स के abluminal पहलू को गले लगाने के अंत फ़ीड । सीएनएस homeostasis बनाए रखने के अलावा NVU सीएनएस में प्रतिरक्षा सेल के अवैध व्यापार को नियंत्रित करता है । सक्रिय लिम्फोसाइटों की कम संख्या सीएनएस की प्रतिरक्षा निगरानी के दौरान BBB शिथिलता या नैदानिक रोग के कारण के बिना endothelial बाधा पार कर सकते हैं । इसके विपरीत, ऐसे मल्टीपल स्केलेरोसिस या अपने पशु मॉडल प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis में (eae) प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के रूप में neuroinflammation के दौरान bbb पार कर सकते है और बाद में glia लिमिटेंस अंततः cns पैरेन्काइमा तक पहुंचने नैदानिक रोग के लिए अग्रणी. सीएनएस पैरेन्काइमा में प्रतिरक्षा सेल माइग्रेशन इस प्रकार एक द्वि-चरणीय प्रक्रिया है जिसमें एनवु के एंडोथीलियल और ग्लाइकल बैरियर में एक क्रमिक प्रवास शामिल है जो विशिष्ट आण्विक तंत्रों को नियोजित करता है । यदि endothelial बाधा भर में उनके पारित होने के बाद, टी कोशिकाओं परिसंवहनी प्रतिजन पर अपने सजाना antigen मुठभेड़-कोशिकाओं को अपने स्थानीय पुनर्सक्रियण बाद में gelatinases के फोकल सक्रियण के लिए अग्रणी तंत्र शुरू होगा पेश, जो टी कोशिकाओं glial बाधा पार और सीएनएस पैरेन्काइमा दर्ज करने के लिए सक्षम हो जाएगा । इस प्रकार, दोनों का आकलन, BBB पारगम्यता और EAE के दौरान सीएनएस में प्रतिरक्षा कोशिका संचय करने के लिए स्थानिक सहसंबंध में एमएमपी गतिविधि NVU के endothelial और glial बाधाओं की अखंडता की हानि निर्दिष्ट करने के लिए अनुमति देता है । हम यहां कैसे सक्रिय प्रतिरक्षण द्वारा C57BL/6 चूहों में eae प्रेरित करने के लिए और बाद में कैसे vivo में bbb पारगम्यता का विश्लेषण करने के लिए बहिर्जात फ्लोरोसेंट tracers का एक संयोजन का उपयोग कर दिखाते हैं । हम आगे दिखाने के लिए, कैसे और कल्पना करने के लिए EAE दिमाग में gelatinase गतिविधि स्थानीयकृत द्वारा सीटू zymogaphy BBB तहखाने झिल्ली और CD45 + प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर आक्रमण के immunofluorescent धुंधला करने के लिए युग्मित ।
Introduction
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) कशेरुका में सभी शरीर और मानसिक कार्यों निर्देशांक, और सीएनएस homeostasis ंयूरॉंस के एक उचित संचार के लिए आवश्यक है । सीएनएस होमियोस्टैसिस न्यूरोवैस्कुलर यूनिट (NVU), जो रक्त प्रवाह के बदलते वातावरण से सीएनएस की रक्षा करता है द्वारा warranted है । NVU CNS माइक्रोवास्कुलर endothelial कोशिकाओं से बना है, जो biochemically अद्वितीय है और रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) pericytes, astrocytes, ंयूरॉंस के साथ निरंतर crosstalk में स्थापित है, और extracellular मैट्रिक्स (ECM) घटकों, दो की स्थापना अलग तहखाने झिल्ली1. एंडोथीलियल तहखाने झिल्ली कि BBB endothelial कोशिकाओं के abluminal पहलू ensheathes pericytes की एक उच्च संख्या बंदरगाहों और अंय ECM प्रोटीन2के अलावा laminin α और laminin α 5, से बना है । इसके विपरीत, पैरेन्काइमल तहखाने झिल्ली में लैमिनिन हैं1 और लैमिनिन α 2 होते हैं और इन्हें एस्ट्रोसाइटिक एंड-फीट से अपनाया जाता है । पैरेन्काइमल तहखाने झिल्ली एक साथ astrocyte अंत फुट के साथ glia लिमिटेंस composes कि मस्तिष्कमेरु द्रव भरा परिसंवहनी या अवजालतनिका रिक्त स्थान3से सीएनएस न्यूरोनल नेटवर्क को अलग करता है । NVU के अद्वितीय वास्तुकला के कारण, सीएनएस में प्रतिरक्षा सेल के अवैध व्यापार परिधीय ऊतकों में से अलग है के रूप में यह प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ एक दो कदम प्रक्रिया की आवश्यकता है, पहले endothelial BBB और बाद में glia लिमिटेंस उल्लंघन करने के लिए सीएनएस पैरेन्काइमा तक पहुंचें ।
मल्टीपल स्केलरोसिस (एमएस) सीएनएस की एक आम न्यूरोभड़काऊ बीमारी है, जिसमें परिसंचारी प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में सीएनएस दर्ज करें और कारण neuroinflammatory, ग्रासलेल्या, और BBB अखंडता4के फोकल नुकसान. bbb अखंडता की हानि एमएस की एक प्रारंभिक पहचान है, के रूप में केएनएस में गैडोलिनियम कंट्रास्ट बढ़ाने घावों की उपस्थिति के रूप में चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई)5द्वारा कल्पना द्वारा संकेत दिया । ल्यूकोसाइट CNS में बहिर्वेशन postcapillary venules के स्तर पर होता है; हालांकि, सटीक BBB तहखाने झिल्ली भर में प्रतिरक्षा कोशिका diapedesis में शामिल तंत्र और बाद में glial बाधा का पता लगाया जा करने के लिए रहते हैं । प्रायोगिक ऑटोइम्यून एनसेफेलोमाइलाइटिस (EAE) एमएस के लिए एक पशु मॉडल के रूप में कार्य करता है और काफी एमएस रोगजनन के बारे में हमारे वर्तमान ज्ञान के लिए योगदान दिया है । उदाहरण के लिए, eae मॉडल का उपयोग कर यह पता चला है कि ल्यूकोसैट बहिर्वेशन एक बहुचरणी प्रक्रिया में होता है, एक प्रारंभिक कब्जा और रोलिंग चरण के रूप में चयनों और mucin द्वारा मध्यस्थता जैसे अणुओं जैसे पी selectin ग्लाइकोप्रोटीन संलग्नी (psgl)-1, integrin निर्भर फर्म गिरफ्तारी और BBB endothelial कोशिकाओं पर टी कोशिकाओं के रेंगने के बाद diapedesis6के लिए स्वतंत्र पक्षों के लिए ।
एक बार टी कोशिकाओं endothelial bbb और endothelial तहखाने झिल्ली को पार कर लिया है, वे मैक्रोफेज या डेन्द्रटिक कोशिकाओं में रणनीतिक रूप से लेप्टोमेनिंगयल या परिसंवहनी रिक्त स्थान में स्थानीयकृत पर अपने सजाना प्रतिजन मुठभेड़ की जरूरत है । यह बातचीत समर्थक भड़काऊ मध्यस्थों है कि बाद glia लिमिटेंस7,8,9के माध्यम से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सीएनएस ऊतक आक्रमण के लिए आवश्यक तंत्र को ट्रिगर के फोकल उत्पादन लाती है । मैट्रिक्स के फोकल सक्रियण-metalloproteinases (एमएमपी)-2 और एमएमपी-9 बदल chemokine सक्रियकरण और एस्ट्रोसाइट के अंत पर extracellular मैट्रिक्स रिसेप्टर्स की गिरावट लाती-पैर, जो में glia लिमिटेंस भर में प्रतिरक्षा सेल प्रवास के लिए एक शर्त है सीएनएस पैरेन्काइमा और EAE10,11के नैदानिक लक्षणों की शुरुआत को प्रेरित करने के लिए ।
सीएनएस के साथ घुसपैठ प्रतिरक्षा सेल का पता लगाने के संयोजन में BBB रिसाव और CNS ऊतक वर्गों में gelatinase गतिविधि neuroinflammation के संदर्भ में endothelial और glial बाधा के कार्यात्मक अखंडता के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करता है । उदाहरण के लिए, हमने हाल ही में एन्डोथेलियल टाइट जंक्शन अणु जंक्शन आसंजन अणु (जैम)-बी की प्रतिरक्षा कोशिका के अवैध व्यापार में सी एन ई के संदर्भ में संवैधानिक हानि की जांच की । स्वस्थ जंगली-प्रकार C57BL/6 चूहों, स्वस्थ जाम बी की कमी के लिए की तुलना में साहित्यकार ने दिखाया bbb अखंडता की कोई हानि के रूप में vivo पारगम्यता आकलन में अंतर्जात का उपयोग कर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बहिर्जात tracers12। EAE के संदर्भ में, जाम बी की कमी C57BL/6 चूहों ameliorated रोग के लक्षण है, जो भड़काऊ कोशिका के साथ जुड़ा हुआ था दिखाया लेप्टोमेनिंगयल और पेरिवैस्कुलर रिक्त स्थान12में फँसाना । इस घटना हम सीटू zymography में लागू की जांच करने के लिए, gelatinase गतिविधि की पहचान की अनुमति के लिए अगर जाम में gelatinase गतिविधि की कमी बी-कमी चूहों प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भंग करने में सक्षम की कम संख्या के लिए जिंमेदार हो सकता है परीक्षण करने के लिए ग्लिया लिमिटेंस12.
अलग आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडलों की कमी की उपलब्धता को देखते हुए, उदाहरण के लिए, अलग BBB तंग जंक्शन अणुओं कि BBB समारोह में परिवर्तन के कारण हो सकता है, BBB अखंडता की जांच के लिए तरीके महत्वपूर्ण हैं । इसके अलावा, नव विकसित दवाओं NVU बाधाओं पर प्रभाव सकता है । यहां हम बताएंगे कि कैसे C57BL/6 चूहों में myelin ओलिगोडेन्ट्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (MOG) के साथ सक्रिय प्रतिरक्षण द्वारा EAE-पेप्टाइड aa35-55 में पूरा Freund सहायक । हम तो समझाने कैसे endothelial और nvu के glial बाधाओं और कैसे vivo endothelial और glial बाधा अखंडता में अध्ययन करने के लिए में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ के लिए स्थानीय रूप से बहिर्जात tracers और gelatinase गतिविधि का पता लगाने में, क्रमशः ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए प्रेरित और EAE की निगरानी में महिला C57BL/ महिलाओं को प्राथमिकता से चुना जाता है, और वहां महिला की एक घटना है: 3:1 के पुरुषों में MS । EAE की गंभीरता का आकलन करने के लिए, हम एक …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कृतज्ञता स्वीकार Lydia सोरोकिन, जो अपने मूल स्वस्थानी zymography प्रोटोकॉल10 में हमारे साथ साझा किया गया है ।
Materials
| AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
| Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
| Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
| Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
| Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
| Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
| Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
| EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
| Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
| Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
| Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
| microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
| NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
| Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
| poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
| repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
| sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
| syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
| syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |
Riferimenti
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