Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

Summary

여기, 선물이 vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 혈관 단위의 장애를 조사 하는 프로토콜. 우리는 특별히 명과 limitans에서 혈액-뇌 장벽 침투성 및 백혈구 마이그레이션에 관련 된 gelatinase 활동을 확인 하는 방법 주소.

Abstract

혈관 단위 (NVU)는 혈액-뇌 장벽 (BBB), 포함 된 pericytes와 내 피 지하실 막 형성 microvascular 내 피 세포의 구성 및 명과 limitans 구성 parenchymal 지하실 막 그리고 astrocytic 끝-피드 중앙 신경 시스템 (CNS) microvessels의 abluminal 측면을 수용. CNS 유지 이외에 항상성은 NVU 면역 세포 CNS에 밀매 제어 합니다. CNS의 immunosurveillance 동안 활성화 된 림프 톨의 낮은 수 BBB 부전 또는 임상 질병을 유발 하지 않고 내 피 방 벽을 교차 수 있습니다. 대조적으로, 다 발성 경화 증 또는 그것의 동물 모델에서와 같은 neuroinflammation 동안 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) 면역 세포의 많은 교차 BBB와 이후 결국 CNS 실질 도달 명과 limitans 임상 질병을 선도. 면역 세포 마이그레이션 CNS 실질에 이렇게 독특한 분자 메커니즘을 채용 하는 NVU의 내 피와 폐해 장벽을 가로질러 순차적 마이그레이션을 포함 하는 2 단계 프로세스 이다. 만약 내 피 장벽을 가로질러 그들의 통행 다음, T 세포 발생 그들의 현지 재 gelatinases의 초점 활성화로 이어지는 후속 메커니즘을 시작할 것 이다 혈관 주위 항 원 제시 세포에 그들의 동족 항 원 하 폐해 방 벽을 교차 하 여 CNS 실질 입력 T 셀 수 있게 된다. 따라서, BBB 침투성 및 MMP 활동 EAE 동안 CNS에 면역 세포 축적에 공간 상관 관계에서 모두, 평가 NVU의 내 피와 폐해 장벽의 무결성의 손실을 지정할 수 있습니다. 우리는 여기 활성 예방 접종에 의해 C57BL/6 쥐에서 EAE를 유도 하는 방법과 이후에 BBB 침투성 생체 조건 exogenous 형광 추적기의 조합을 사용 하 여 분석 하는 방법을 보여줍니다. 우리 더 쇼, 시각화 하 고 현장에서 zymogaphy immunofluorescent stainings BBB 지하실 막과 CD45 + 침입 면역 세포의 결합에 의해 EAE 두뇌에 gelatinase 활동을 지역화 하는 방법.

Introduction

모든 신체 및 척추 동물, 정신 기능을 조정 하는 중앙 신경 시스템 (CNS) 그리고 CNS 항상성 뉴런의 적절 한 의사 소통을 위해 필수적 이다. CNS 항상성 neurovascular 단위 (NVU) CNS의 혈 류 변화 환경에서 보호에 의해 보증 된다. NVU 2 설정 CNS microvascular 내 피 세포의 화학적 고유 하 고 지속적인 누화와 pericytes, 이다, 신경, 세포 외 기질 (ECM) 구성 요소에에서 혈액-뇌 장벽 (BBB)를 설정, 구성 고유한 지하실 막¹. 내 피 지하실 막 BBB 내 피 세포의 abluminal 측면 pericytes의 높은 수 항구 이며 laminin α4와 다른 ECM 단백질²뿐만 아니라 laminin α5는 ensheathes. 반면, parenchymal 지하실 멤브레인 laminin α1 및 laminin α2의 구성 되어 있으며 astrocytic 끝-피트에 의해 포용입니다. 사이토 끝-피트 함께 parenchymal 지하실 멤브레인 가득 척수 혈관 주위 또는 거미 막 밑 공간³에서 CNS 신경 네트워크 분리 명과 limitans를 작성 합니다. NVU의 독특한 구조 때문에 CNS에 밀매 하는 면역 세포는 다릅니다 그 주변 조직으로 면역 세포는 2 단계 과정을 필요로 하 고, 먼저 위배 내 피 BBB와 그 후에 명과 limitans CNS 실질에 도달 합니다.

다 발성 경화 증 (MS)은 CNS, 순환 하는 면역 세포의 많은 CNS 입력 한 neuroinflammation, demyelination, 및 BBB 무결성⁴의 초점 손실의 일반적인 neuroinflammatory 질병 이다. BBB 무결성의 손실 가돌리늄 대조 자기 공명 영상 (MRI)⁵시각으로 CNS 병 변 강화의 존재에 의해 나타나는 것과 같이, MS의 초기 특징입니다. Postcapillary venules;의 수준에서 발생 하는 CNS에 백혈구 넘쳐 흐름 그러나, 면역 세포 diapedesis BBB 지하실 멤브레인와 이후 폐해 장벽에에서 관련 된 정확한 메커니즘 탐험 남아 있다. 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) ms는 동물 모델 역할 하 고 MS 병 인에 대 한 우리의 현재 지식에 크게 기여 했다. 예를 들어, EAE 모델을 사용 하 여 그것 발견 되었습니다 백혈구 넘쳐 흐름 초기 캡처를 포함 한 다단계 프로세스에서 발생 하 고 풀과 P selectin 당단백질 리간드 (PSGL)-1, 같은 mucin 같은 분자에 의해 중재 단계를 압 연 integrin 종속 회사 체포와 diapedesis⁶관대 면 BBB 내 피 세포에서 T 세포의 크롤 링에 의해 따라.

일단 T 세포는 내 피 BBB와 내 피 지하실 막 넘어, 그들은 그들의 동족 항 원 대 식 세포 나 수지상 세포를 환자의 또는 혈관 주위 공간에 전략적으로 지역화를 발생 해야 합니다. 이 상호 작용 그 트리거 후속 메커니즘 명과 limitans^7,,89통해 면역 세포의 CNS 조직 침공에 필요한 프로-염증 성 중재자의 초점 생산을 유도 합니다. 매트릭스-metalloproteinases (MMP)-2 및 MMP 9의 초점 활성화 chemokine 활성화를 유도 하는 면역에 대 한 전제 조건 인 사이토 끝-피트, 수용 체 세포 외 매트릭스의 저하로 명과 limitans에서 마이그레이션 셀은 CNS 실질 EAE^10,11의 임상 증상의 발병을 유도 하 고.

BBB와 면역 세포를 침투 하는 CNS의 탐지를 결합 하 여 CNS 조직 섹션에서 누설 및 gelatinase 활동 neuroinflammation의 맥락에서 내 피 및 폐해 장벽의 기능 무결성에 대 한 귀중 한 정보를 제공 합니다. 예를 들어, 우리는 최근 내 피 꽉 접합 분자 접합 접착 분자 (잼)의 제정 손실 조사-B 면역 세포 EAE의 맥락에서 CNS에 인신 매매. 건강 한 야생-타입 C57BL/6 마우스에 비해, vivo에서 침투성 평가 생 뿐만 아니라 외 인 추적기¹²를 사용 하 여 같이 건강 한 잼-B-결핍 littermates BBB 무결성의 아무 장애를 보였다. EAE의 맥락에서 잼 B 불충분 한 C57BL/6 마우스 환자 및 혈관 주위 공간¹²염증 성 세포 트래핑와 연결 했다 ameliorated 질병 증상을 보였다. 이 현상 검사 우리가 적용 현장에서 zymography, 잼-B-불충분 한 쥐에 gelatinase 활동의 부족은 면역 세포 위반 수의 감소 된 숫자에 대 한 책임이 있을 수 있습니다 하는 경우 테스트 하기 위해 gelatinase 활동의 식별을 허용 합니다 명과 limitans¹².

가용성을 감안할 때 다른 유전자 수정 마우스 모델 부족, 예를 들어, BBB 기능에 변화를 일으킬 수 있는 다른 BBB 꽉 접합 분자 BBB 무결성 조사 방법론은 중요 하다. 또한, 새로 개발된 된 약물 NVU 장벽에 영향을 줄 수 있습니다. 여기 우리가 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG)와 활성 예방 접종에 의해 C57BL/6 쥐에서 EAE를 유도 하는 방법을 보여줍니다-완전 한 Freund adjuvants에서 펩 티 드 aa35-55. 우리 다음 exogenous 추적기와 gelatinase 활동의 현장에서 감지 하 여 각각 vivo에서 내 피 및 폐해 장벽 무결성을 공부 하는 방법은 NVU의 내 피 및 폐해 장벽을 통해 면역 세포 침투를 지역화 하는 방법을 설명 합니다.

Protocol

모든 연구 동물의 보호에 스위스 법률에 따라 지침에 따라 실시 했다 고 구획의 베른, 스위스의 수의 사무실에 의해 승인 (허가 번호: 31/17 수 고 수 77/18). 1. 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 조건에서 C57BL/6 마우스의 주택 집 쥐 개별 환기 케이지 12/12 h 빛-어둠에에서 주기. 음식을 제공 하 고 광고 libidum 물. 쥐의 미생물 품질 감독, 실험 코 호트 분기 상태 모니터링 더러운 침…

Representative Results

C57BL/6 쥐에서 EAE의 임상 과정의 평가 질병 곡선 그림 2A 와 그림 2B에 제시 된으로 마우스 몸 무게 변화에 묘사 된 대로 발생 한다. MOGaa35-55 일반적으로 접종 하는 C57BL/6 마우스 활성 예방 접종 (그림 1A) 후 하루 10-12 주위 질환 증상을 개발 하기 시작 합니다. 일반적으로, 면역된 생쥐 유제의 주입 및 백 일 해 독 소 (그…

Discussion

여기, 선물이 유도 하 고 여성 C57BL/6 쥐에서 EAE 모니터링 프로토콜. 여성은 우선적으로 선택 하 고, 그리고 여자의 발생률: MS에서 3: 1의 남자. 우리가 만든 EAE의 심각도 평가 하기 위해 3-포인트 점수 시트의 사용. EAE 심각도 모터 장애의 심각도 관하여 일반적으로 득점 된다. 마우스와 고급 EAE의 단계, 즉 2 위 점수를 전시 동물의 불필요 한 고통을 피하기 위해 희생 되어야 한다. 따라서,는 것이 좋습…

Materials

AMCA anti-rabbit antibody	Jackson ImmunoResearch	111-156-045	Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11)	Pharmingen	07-1401	Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody	DAKO	Z0097	Store at 4 °C
Breeding food	e.g. PROVIMI KLIBA SA	3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III	e.g. Tecniplast	1145T, 1285L
BSA fraction V	Applichem	A1391	Store at 4 °C
Cold gelatine	Sigma-Aldrich	G 9391
Coplin jar + rack	e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG	H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody	Jackson ImmunoResearch	111-156-144	Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1	e.g. Thermo Scientific	85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW)	e.g. Molecular probes	D22910	Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW)	Invitrogen	D3328	Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit	Thermo Fisher Scientific; EnzCheck	E12055	Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks)	e.g. Janvier Labs		Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides	e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG	2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle	e.g. BD, BD Microlance 3	304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle	e.g. BD, BD Microlance 3	302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle	e.g. BD, BD Microlance 3	304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	e.g. Santa Cruz Biotechnology	sc-24648	Store at 4°C
Maintenance food	e.g. PROVIMI KLIBA SA	3436
MOGaa35-55 peptide	e.g. GenScript		Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus )	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA	e.g. BD	231141	Store at 4 °C
NaCl 0.9 %	B. Braun	3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek )	Sakura	4583
Omnican 50 30G x ½’’	B. Braun	9151125S
Paraformaldehyde	Merck	30525-89-4
Pertussis toxin	e.g. List biological laboratories, Inc.	180	Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88)	Sigma-Aldrich	81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche)	Sigma-Aldrich	4693132001	Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen	e.g. DAKO	S2002
sealing film e.g. Parafilm M	e.g Sigma-Aldrich	P7793
Silica gel	e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG	9351.1
Stitch scissor	F.S.T	15012-12
syringe 1 ml	e.g. PRIMO	62.1002
syringe 10 ml	e.g. CODAN Medical ApS	2022-05
vaporizer system Univentor 400	UNO.BV