تحليل تريساكتشاريديس الحليب فوكوسيلاتيد الإنسان في سياق التكنولوجيا الأحيائية باستخدام جينياً ترميز أجهزة استشعار العوامل البيولوجية
Summary
يصف لنا هنا كشف الفائق والتقدير الكمي فوكوسيلاتيد لبن oligosaccharides (إهمال) استخدام بيوسينسور كامل الخلية. كما نبدي هنا، تكييف هذا البرنامج نحو تحليل لسلالات إنتاج مؤمن، مع التركيز على تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء.
Abstract
Oligosaccharides اللبن البشري (إهمال) عناصر الكربوهيدرات المعقدة في لبن الثدي البشري الذي يحمل فوائد وفيرة على صحة الرضع. ومع ذلك، يقتصر التحسين على التوليف التكنولوجيا الحيوية الإنتاجية منخفضة نسبيا من الكشف والتحديد الكمي لأحادي والروابط. وتشمل التقنيات التقليدية لتحليل جليكان طرق الكروماتوغرافي/الجماهيري-والمطيافيه مع الإنتاجية بناء على أمر من مئات العينات يوميا دون التنفيذ التلقائي. نظهر هنا، بيوسينسور بكتيرية مرمزة وراثيا لكشف الفائق، والخاصة بالربط والتقدير الكمي لهياكل فوكوسيلاتيد مؤمن و 2-فوكوسيلاكتوسي 3-فوكوسيلاكتوسي، الذي يمكننا تحقيقه عن طريق مغايرة التعبير عن فوكوسيداسيس. كما يمكن أن يؤدي وجود اللاكتوز في الحليب أو في العمليات الحيوية لايجابيات كاذبة، علينا أن نبرهن أيضا الحد الإشارات من اللاكتوز استخدام استراتيجيات مختلفة. نظراً للإنتاجية العالية لهذه التقنية، يمكن جزيئي العديد من شروط رد فعل أو معلمات مفاعل حيوي في نفس الوقت في بضع ساعات، مما يسمح للاستفادة المثلى التصنيع مؤمن.
Introduction
Oligosaccharides اللبن البشري (إهمال) هي مشتقة من اللاكتوز-oligosaccharides، عادة ما تتألف من ثلاث إلى ثماني السكر مونومرات. لديهم اللاكتوز (غال-β1، 4-جنة الضوء الأخضر) الحد من نهاية وهي ممدود المزيد من الروابط glycosidic (بيتا-1، 3-أو β-1، 6-) الجلوكوز (الأخضر)، واللبن (Gal)، أو ن-أسيتيلجلوكوساميني (جلكناك). وباﻹضافة إلى ذلك، فوكوسي (الجبهة، α-1، 2–أو α-1، 3-) أو حمض اللعابي (سيا أو نيواك، α-2 و 3-أو α-2، 6-) المخلفات غالباً ما يتم إضافة1.
التحليل الحالي أوليجوساكتشاريديس والكربوهيدرات الأخرى محدودة في الإنتاجية والنطاق بالحاجة إلى والمطيافيه الكروماتوغرافي/الكتلة (MS) التكنولوجيا2،3،،من45، 6 , 7، والذي يمكن أن يستغرق حوالي ساعة كل عينة، ناهيك عن الضرورة لمعدات غالية الثمن والأعمدة المتخصصة ووكلاء ديريفاتيزينج والخبرة في تشغيل هذه المعدات8. الروابط oligosaccharide تتسم بصعوبة خاصة لتحديد، تتطلب متقدمة MS9،10 أو تقنيات الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي)11. التحسين السريع لتوليف لهذه أوليجوساكتشاريديس وبالتالي يحد من الإنتاجية من هذه الخطوة التحليلية بطيئة.
في هذه الدراسة، ونظهر الكشف الخاصة بالربط من تريساكتشاريدي فوكوسيلاتيد إهمال يستند اللاكتوز، مع التركيز على 2 ‘–فوكوسيلاكتوسي (2-فلوريدا) هو مؤمن الأكثر وفرة في اللبن البشري، وراثيا تم ترميزه باستخدام خلية كله الإشريكيّة القولونية بيوسينسور حدا للكشف على 4 مغ/لتر. من السمات هامة لهذا بيوسينسور هو قدرته على التفريق بين تريساكتشاريديس متجازئه. يستند مبدأ التصميم إلى التعبير عن فوكوسيداسيس محددة في كولاي أن تحرير اللاكتوز من إهمال، هو الكشف عن وجود التي بها مشغل أمريكا اللاتينية والكاريبي ، الذي يولد بدوره إشارة فلورسنت. يمكننا تحقيق ذلك من خلال بناء نظام بلازميد اثنين، واحد إيواء فوكوسيداسي الخاصة بالربط والآخر بروتين مراسل فلورسنت. منصة بيوسينسور هذا مناسبة للفرز الفائق بالتدفق الخلوي أو قارئ لوحة صغيرة. كما نبدي الاستفادة بيوسينسور في التحديد الكمي 2 ‘–فلوريدا التي تنتجها سلالة المهندسة12. ضمن هذه الدراسة، كما نقدم ثلاث استراتيجيات في إزالة انتقائية من اللاكتوز التي يمكن أن تسفر عن إشارة إيجابية كاذبة من بيوسينسور، نظراً لأن يزرع سلالة منتج هندسيا على اللاكتوز.
أخذت معا، هذه الأجهزة المشفرة جينياً يسمح لنا بكشف وتحديد إهمال في طريقة الربط على حدة، وصعبة حتى مع الكروماتوغرافي، مرض التصلب العصبي المتعدد، أو الرنين المغناطيسي تقنيات. ينبغي أن يكون هذا الأسلوب نظراً للإنتاجية العالية وسهولة الاستخدام، تطبيقات على نطاق واسع في الهندسة الأيضية وتوليف من إهمال.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم استراتيجية الفائق لكشف الروابط الخاصة فوكوسيلاتيد أوليجوساكتشاريديس اللبن البشري. كان ذلك عن طريق بناء خلية كله أجهزة استشعار العوامل البيولوجية عن طريق الهندسة وراثيا كولاي التي تستجيب مع إشارة فلورسنت عند الاستقراء مع جليكانس محددة. تفاصيل البروتوكول أيضا على كيف يمكن استخ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل “أموال بدء التشغيل جامعة الدولة آيوا”. جزئيا في تمويله هو زمالة ترينيكت جبهة الخلاص الوطني والاستاذية هوبة مانلي. T.J.M. أيده جزئيا كارين وزمالة كلية فوغن ديني. يشكر المؤلفون آيوا جامعة الدولة تدفق مرفق الخلوي ومختبر أبحاث جميع كيك للمساعدة مع الأسفار ودراسات LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.
Materials
| 2’-Fucosyllactose | Carbosynth | 41263-94-9 | |
| 3-Fucosyllactose | Carbosynth | 41312-47-4 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Flow Cytometer | BD | FACSCanto Plus RUO | |
| HPLC | Agilent Technologies | 1100 Series HPLC system | |
| HPLC Column | Luna | C18 reversed phase column | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | 11815024 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Lactose | Fisher Scientific | 64044-51-5 | |
| M9, Minimimal Salts, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| MS | Agilent Technologies | Mass Selective Trap SL detector | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 13472-35-0 |
Riferimenti
- Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).
- Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).
- Royle, L. Chapter 8 – Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).
- Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).
- Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).
- Evangelista, R. A., Liu, M. -. S., Chen, F. -. T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).
- Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).
- Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).
- Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -. P., Tsai, S. -. T., Ni, C. -. K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).
- Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).
- Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).
- Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).
- Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
- Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).
