Fucosylated 인간 우유 Trisaccharides 유전자를 사용 하 여 바이오 컨텍스트에서 분석 인코딩된 바이오 센서
Summary
우리 여기 높은 처리량 탐지 및 정량화 fucosylated 인간의 우유 oligosaccharides (Hmo)의 전체 셀 바이오 센서를 사용 하 여 설명 합니다. 또한 설명 여기, HMO 생산 종자의 분석으로이 플랫폼의 적응 신호 대 노이즈 비를 향상에 초점을 맞추고 합니다.
Abstract
인간의 우유 oligosaccharides (Hmo)는 복잡 한 탄수화물의 구성 요소 인간의 모유는 유아 건강에 많은 혜택. 그러나, 그들의 바이오 합성의 최적화는 탐지의 상대적으로 낮은 처리량 및 단 당 류와 연계의 정량화에 의해 제한 됩니다. Glycan 분석의 전통적인 기술을 자동화 없이 하루 샘플 수백 순서 처리량 크로마/질량-spectrometric 메서드가 포함 됩니다. 여기, 높은 처리량, 연계 관련 검색 및 fucosylated HMO 구조, 2′-fucosyllactose와 3-fucosyllactose, 우리는 분리를 통해 달성의 정량화에 대 한 유전자 인코딩된 세균성 바이오 센서 설명 fucosidases의 표현입니다. 으로 유 당 우유 또는 바이오 프로세스의 존재는 가양성으로 이어질 수 있는, 우리 또한 다른 전략을 사용 하 여 유 당에서 신호 감소를 보여줍니다. 이 기술은 높은 처리량으로 인해 많은 반응 조건 또는 생물 매개 변수 HMO 제조의 최적화에 대 한 허용 하는 시간의 문제에 동시에 분석 될 수 있습니다.
Introduction
인간의 우유 oligosaccharides (Hmo) 유 당 파생 oligosaccharides, 일반적으로 3 ~ 8 설탕 단위체로 구성 된 있습니다. 그들은 끝 (Gal β1, 4-Glc) 유 당 감소 그리고 더 glycosidic 링크에 의해 길쭉한 (β-1, 3-또는 β-1, 6-) 포도 당 (Glc), 갈 락 토스 (Gal), 또는 N-acetylglucosamine (GlcNAc). 또한, fucose (Fuc, α-1, 2-또는 α-1, 3-) 또는 sialic acid (Sia 또는 NeuAc, α-2, 3-또는 α-2, 6-) 잔류물은 종종1추가.
Oligosaccharides과 다른 탄수화물의 현재 분석 크로마/질량 spectrometric (MS) 기술2,3,,45, 에 대 한 필요에 의해 처리량 그리고 범위에 제한 됩니다. 6 , 7, 대략 걸릴 수 있는이 장비8의 가동에 고가의 장비, 특수 열과 derivatizing 에이전트 및 전문성에 대 한 필요성을 언급 하지 않기 위하여 샘플 당 한 시간. 올리고 당 연계는 특히 어려운 결정, 고급 MS9,10 또는 핵 자기 공명 (NMR) 기법11. 이러한 oligosaccharides의 합성의 빠른 최적화 따라서이 느린 분석 단계의 처리량에 의해 제한 됩니다.
이 연구에서 설명 하는 fucosylated trisaccharide의 연계 관련 검색 유 기반 Hmo, 2′-fucosyllactose (2′-플로리다) 인간의 우유에 있는 가장 풍부한 HMO에 초점을 맞추고, 유전자 암호화를 사용 하 여 대장균 전체 셀 4 mg/l.에서 검출 한도 바이오 센서 이 바이오 센서의 중요 한 기능은 이성질체 trisaccharides 사이 구별 하는 기능입니다. 디자인 원리는 존재에 형광 신호를 생성 하는 락 오 페론에 의해 검출 된다 Hmo에서 유 당을 해방 하는 대장균 의 특정 fucosidases의 식을 기반으로 합니다. 우리는 링크 전용 fucosidase와 다른 형광 기자 단백질을 품고 하나 2-플라스 미드 시스템을 구축 하 여 이것을 달성. 이 바이오 센서 플랫폼은 높은 처리량 검열 cytometry 또는 마이크로 플레이트 리더에 적합 합니다. 우리는 또한 2′-플로리다 설계 변형12제작한 측정에 바이오 센서의 활용을 보여 줍니다. 이 연구에서 또한 선물이 세 가지 전략, 바이오 센서에서 거짓 긍정적인 신호에서 발생할 수 있는 유 당의 선택적 제거에 조작된 프로듀서 스트레인 성장 유 당에는.
함께 찍은, 유전자 인코딩된 바이오 센서 수 감지 하 고도 어려운 연계 특정 방식으로 Hmo를 계량 컬럼에, MS, 또는 NMR 기법. 높은 처리량 및 사용의 용이성,이 메서드는 대사 공학 및 Hmo의 합성에 광범위 하 게 응용 프로그램 있어야 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 인간 우유 oligosaccharides fucosylated의 연계 관련 검색에 대 한 높은 처리 전략 제시. 이 특정 glycans와 유도 따라 형광 신호 응답 대장균 유전자 공학에 의해 전체 셀 바이오 센서를 구축 하 여 달성 되었다. 프로토콜 또한 감지 metabolically 조작된 세균성 긴장에 Hmo를 계량 하는 바이오 센서를 사용 하는 방법에 자세히 설명 합니다.
우리의 프로토콜 크로마/MS 방법에 비?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 아이오와 주립 대학 시작 기금에 의해 지원 되었다. F.E.는 NSF Trinect 친교와 맨리 Hoppe 교수에 의해 부분적으로 투자 되었다. T.J.M. 카 렌과 데 니 본 학부 친목에 의해 부분적으로 지원 되었다. 저자 형광와 LC MS 연구 아이오와 주립 대학 Flow Cytometry 시설 및 W.M. 켁 대사체학 연구 실험실 지원에 대 한 감사합니다.
Materials
| 2’-Fucosyllactose | Carbosynth | 41263-94-9 | |
| 3-Fucosyllactose | Carbosynth | 41312-47-4 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Flow Cytometer | BD | FACSCanto Plus RUO | |
| HPLC | Agilent Technologies | 1100 Series HPLC system | |
| HPLC Column | Luna | C18 reversed phase column | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | 11815024 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Lactose | Fisher Scientific | 64044-51-5 | |
| M9, Minimimal Salts, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| MS | Agilent Technologies | Mass Selective Trap SL detector | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 13472-35-0 |
Riferimenti
- Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).
- Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).
- Royle, L. Chapter 8 – Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).
- Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).
- Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).
- Evangelista, R. A., Liu, M. -. S., Chen, F. -. T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).
- Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).
- Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).
- Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -. P., Tsai, S. -. T., Ni, C. -. K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).
- Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).
- Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).
- Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).
- Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
- Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).
