1型糖尿病生物制药候选疫苗在红甜菜中的瞬态表达

Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 以产生一个口服疫苗候选1型糖尿病在食用植物。

Abstract

植物分子耕作是利用植物生产感兴趣的分子。从这个角度来看, 植物既可以作为生物反应器, 用于生产和随后纯化最终产品, 也可以用于使用可食用植物物种时直接口服异源蛋白质。在这项工作中, 我们提出了一个候选口服疫苗1型糖尿病 (T1D) 在食用植物系统中使用解构植物病毒重组 DNA 技术, 以真空渗透交付。我们的研究结果表明, 红甜菜是一个合适的宿主, 用于与 T1D 相关的人类衍生自身抗原的瞬态表达, 被认为是 T1D 疫苗的一个有希望的候选疫苗。对产生自体抗原的叶片进行了彻底的检测, 以了解其对胃消化的抵抗力、残留细菌电荷的存在以及对其的次生代谢状况, 并概述了该过程中的生产, 以便对其潜在的用途进行概述用于直接口服异源蛋白的植物。我们的分析显示, 在模拟胃消化后, 冻干候选口服疫苗几乎完全降解, 这表明在制造植物衍生的 GAD 疫苗时需要一种封装策略。

Introduction

自20世纪80年代植物分子生物学革命以来, 以植物为基础的生物制药生产系统可以被认为是基于微生物和哺乳动物细胞^{1 的}传统系统的替代品。与传统平台相比, 工厂具有多种优势, 可扩展性、成本效益和安全性是最相关^{的 2}。重组产物可以从转化后的植物组织中纯化, 然后在肠外或口服, 此外, 转化后的食用植物可以直接用于口服。口腔途径同时促进黏膜和全身免疫, 消除了对针头和专业医务人员的需求。此外, 口服可消除复杂的下游加工, 而下游加工通常占重组蛋白³制造总成本的80%。所有这些优势都可以转化为在生产、供应和劳动力方面的节约, 降低每剂的成本, 使全球大多数人口都能负担得起这种药物。

为植物重组蛋白的生产, 提出了几种稳定转化和瞬态表达的策略。其中, 一种高产量解构的植物病毒表达系统 (如 Mamonicon) 提供了卓越的性能, 在相对较短的时间范围内提高了重组蛋白的高产量⁴。报道了在作为金标准生产宿主的烟碱植物中使用植物病毒表达系统的许多瞬态表达的例子。然而, 这种示范植物并不被认为是一种可食用的物种, 因为它的叶子中积累了生物碱和其他有毒代谢物。

在这项工作中, 我们描述了两个可食用的植物系统的比较, 红色甜菜 (贝塔寻常的 Cv红磨坊) 和菠菜 (菠菜就是cv 工业), 表达了两种候选形式的 65 kda 谷氨酸异形脱羧酶 (GAD65), 由基于植物病毒的载体⁵进行。GAD65 是一种与1型糖尿病 (T1D) 相关的主要自身抗原, 目前正在人体临床试验中进行研究, 以通过诱导耐受性⁶来预防或延缓 T1D。在植物中生产 gad65 的过程中, 以烟叶和5%、⁶、^7为典型植物种类进行了广泛的研究。在这里, 我们描述了使用食用植物物种生产的分子组织, 可用于直接口服。从技术角度出发, 通过对重组蛋白表达水平、植物残留微生物电荷等不同参数的评价, 研究并选择了 GAD65 生产的植物农业渗透系统和食用植物平台。用于口服的组织, GAD65 对胃消化的抵抗力, 以及转化后的植物与野生类型的生物等效性。

Protocol

1. 红甜菜和菠菜栽培 生长红甜菜(b. vulgaris cv红磨坊) 和菠菜 (s.深恶痛绝 cv industria) 植物在生长室中, 分别使用150μe 的光强, 65% 相对湿度, 在231°c 下12小时光/暗周期。 种子萌发后, 每周用市售肥料的 1 gl 溶液 (材料表) 给植物施肥两次。对于农业渗透使用5周龄菠菜和6周龄的红甜菜植物。 2. 解构植物病毒技术的瞬态表达 植物?…

Representative Results

本文介绍了在食用植物组织中开发口服疫苗的工作流程。这项工作的重点是在可食用寄主植物物种中表达目标蛋白和对潜在口服疫苗的定性。 第一步是评估基于植物病毒的表达技术是否适合在食用植物系统中产生重组蛋白。为此, 我们首先使用 eGFP 作为模型蛋白, 并将其表达为两个可食用的叶植物系统: 红甜菜和菠菜。植物通?…

Discussion

在这项研究中, 我们对自身免疫性糖尿病候选口服疫苗的设计进行了初步分析。本实验的目标蛋白是人类 65 kDa 谷氨酸脱羧酶的突变形式, 其生产和功能易于检测和测量 12.它在不同食用植物组织中的表达是由载体⁵介导的, 在很短的时间内介导高水平的重组蛋白产生。根据红甜菜和菠菜叶片中 eGFP 表达的方法, 通过人工农业浸润, 选择了最佳候选植物食用寄主。由?…

Materials

0.2-μm Minisart RC4 membrane filters	Sartorius-Stedim	17764
2–mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma	M8250	pH 5.5
96-well plate	Sarstedt	833924
Acetic acid	Sigma	27221	Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade	Sigma	34967
Acetosyringone	Sigma	D134406	Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949	15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate	Sigma	70221
Anti-eGFP antibody	ABCam	ab290
Anti-GAD 65/67 antibody	Sigma	G5163
Anti-LHCB2 antibody	Agrisera	AS01 003
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
C18 Column	Grace	–	Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column	Grace	–	Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower	Peter Excel	15-5-15	Fertilizer
Carbenicillin disodium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxic
Chemiluminescence imaging system	BioRad	1708370	ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform	Sigma	C2432
Detergent	Sigma	P5927	Polysorbate 20
Fluorescence reader	Perkin-Elmer	1420-011	VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade	Sigma	94318
Glycerol	Sigma	G5516	15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase	Promega	M7841
HCl	Sigma	H1758	Corrosive
HILIC Column	Grace	–	Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column	Grace	–	Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody	Sigma	A6154	Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler	Beckman Coulter	–	System Gold 508 Autosampler
HPLC System	Beckman Coulter	–	System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol	Sigma	24137	Flamable
Kanamycin sulfate	Sigma	K4000	Toxic
KCl	Sigma	P9541	2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4	Sigma	P9791	2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution	Ge Healthcare	RPN2232	Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator	5Pascal	LIO5P0000DGT
Mass Spectometer	Bruker Daltonics	–	Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol	Sigma	32213
MgSO4	Sigma	M7506
Milk-blocking solution	Ristora	–	3 % in PBS
Na2HPO4	Sigma	S7907	Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl	Sigma	S3014	80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4	Sigma	S8282	Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH	Sigma	S8045
Nitrocellulase membrane	Ge Healthcare	10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P7000
Peroxidase substrate ECL	GE Healthcare	RPN2235	Light sensitive material
Pump Vacuum Press	VWR	111400000098
Reagent A	Sigma	B9643	Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B	Sigma	B9643	Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite	Sigma	7681-57-4
Sonicator system	Soltec	090.003.0003	Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe	Terumo	–
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes	Thermo Scientific	11573680
Trizma Base	Sigma	T1503	Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone	Formedium	TRP03	10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator	Heto	3878 F1-3	Speed-vac System
Water LC-MS grade	Sigma	39253
Yeast extract	Sigma	Y1333	5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade