1 型糖尿病のバイオ医薬品候補ワクチンの赤カブの一過性発現
Summary
ここでは、食用植物の 1 型糖尿病に対する経口ワクチン候補を生成するためのプロトコルを提案する.
Abstract
分子農業の興味の分子を生成するために植物の使用であります。このような観点で植物が両方使用するバイオリアクターとして生産と最終製品のそれに続く浄化のため、異種蛋白質の直接の口頭配達の食用植物の種を使用する場合。この作品は、食用植物を用いて解体工場ウイルスによる組換え DNA 技術、真空浸潤と配信のタイプ 1 の糖尿病 (T1D) に対する候補の経口ワクチンの開発を紹介します。我々 の結果は、赤いビーツが T1D ワクチンとして有望な候補であると T1D に関連付けられている人間の派生疱瘡一過性発現に適したホストであることを示します。胃消化に対する抵抗力、細菌の残留電荷の存在および潜在的な使用のためのプロセス生産の概要を与える彼らの二次代謝プロファイル、自己抗原の生産葉が特徴付けられた徹底的に植物による異種タンパク質の直接の口頭配達のため。我々 の分析を示した次のシミュレートされた胃の消化は、GAD の植物由来ワクチンの製造にカプセル化戦略が必要なことを示唆している凍結候補の経口ワクチンのほぼ完全劣化。
Introduction
1980 年代に植物分子生物学の革命以来バイオ医薬品の生産のための植物ベースのシステムは、微生物や哺乳動物細胞1に基づく従来のシステムに代わるものとして考えることが。植物は、スケーラビリティ、費用対効果と安全が最も関連性の高い2伝統的なプラットフォーム上のいくつかの利点を表示します。遺伝子組換え製品の形質転換体組織から精製や、経口的、どちらか口頭配達の直接変換の食用植物を使用ことができます経口投与し、また、することができます。経口ルートは同時に粘膜と全身の免疫を促進し、針や専門の医療関係者のための必要があります。さらに、口頭配達は通常組換え蛋白質3の総製造費用の 80% を占めている複雑なダウン ストリーム処理を排除します。すべてのこれらの利点は、生産、供給および労働の各投与量、世界の人口のほとんどが薬を手頃な価格のコスト削減で節約に翻訳できます。
安定した変換と過渡式の両方のいくつかの戦略は、植物における遺伝子組換え蛋白質の生産のために開発されました。その中で、高収率解体工場式のウイルス ベース システム (例えば、magnICON) は比較的短いタイム スケール4で組換えタンパク質の高収率をリードする優れた性能を提供します。ベンサミアーナ タバコ植物の植物ウイルス ベースの式を用いた一過性発現の多くの例が報告されているゴールド スタンダード本番ホストをされています。ただし、このモデルの植物はアルカロイドとその葉の蓄積は、他の毒性代謝産物により食用種とみなされない。
この作品は、赤ビート 2 つの食用植物システムの比較について述べる (ベータ版尋常 cvムーラン ルージュ) とほうれん草 (及ぼす oleracea cvインドゥストリア)、グルタミン酸の 65 kDa のアイソ フォームの 2 つの候補形式の表現のため脱炭酸酵素 (GAD65) 植物ウイルス ベースで実施の5 をベクトルします。GAD65 はタイプ 1 の糖尿病 (T1D) に関連付けられている主要な自己抗原と、それは現在または許容値6を誘導することによって T1D を遅延するを防ぐため人間臨床試験で調査中。植物における GAD65 の生産は、タバコと(名) ベンサミアーナ4,5,6,7としてモデル植物で広く研究されています。ここでは、直接口頭配達のために意味することができます組織の分子の生産のための食用植物の種の使用について述べる。ビューの技術的な観点から検討し、異なるパラメーターを評価することによって植物の agroinfiltration のシステムと GAD65 の生産のための食用植物プラットフォームを選択: 組換え蛋白質の表現のレベル、残留微生物工場にて組織の口頭配達、胃の消化に GAD65 の抵抗と野生型に変換された植物の同等のためのもの。
Protocol
1. 赤いビーツとホウレンソウの栽培 赤カブを育てる (B の尋常性 cvムーラン ルージュ) とほうれん草 (s. キャベツ cvインドゥストリア) 23/21 ° C でそれぞれ照度, 相対湿度 65%, 12 時間の明暗サイクルの 150 Με を使用して成長部屋の植物。 種子発芽後市販肥料 (材料表) の 1 グラム/L の溶液で週二回植物を肥やしなさい。Agroinfiltration 5 週齢ほうれん草と 6 ?…
Representative Results
この作品は、食用植物組織の経口ワクチンの開発のためのワークフローが表示されます。この作品の焦点は、食用宿主植物のターゲット蛋白質の発現と潜在的な経口ワクチンの評価です。 最初のステップでは、食用植物システムで組換えタンパク質を生産する植物ウイルス ベース式技術の適合性の評価を関与しています?…
Discussion
本研究では、自己免疫の糖尿病のための候補者の経口ワクチンの設計のための予備的な分析を示した。この実験のターゲット蛋白質は人間 65 kDa の生産と機能が、容易に検出および測定可能な12グルタミン酸脱炭酸酵素の変異する形式だった別の食用の植物の組織での発現ベクトル5では非常に短い時間枠で組換えタンパク質生産の高いレベルを仲介媒介だ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は「自己免疫性糖尿病食用ワクチン (eDIVA) 生産ため植物の使用」の共同プロジェクトによって支えられた (プロジェクト ID: 891854) 呼び出し 2014 のフレームワークで、ヴェローナ大学によって資金を供給。
Materials
| 0.2-μm Minisart RC4 membrane filters | Sartorius-Stedim | 17764 | |
| 2–mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
| 96-well plate | Sarstedt | 833924 | |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Acetonitrile LC-MS grade | Sigma | 34967 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone |
| Ammonium formate | Sigma | 70221 | |
| Anti-eGFP antibody | ABCam | ab290 | |
| Anti-GAD 65/67 antibody | Sigma | G5163 | |
| Anti-LHCB2 antibody | Agrisera | AS01 003 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| C18 Column | Grace | – | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| C18 Guard Column | Grace | – | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | Fertilizer |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Chemiluminescence imaging system | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch Imaging System |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Detergent | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
| Fluorescence reader | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
| Formic acid LC-MS grade | Sigma | 94318 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol |
| GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| HILIC Column | Grace | – | Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column |
| HILIC Guard Column | Grace | – | Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard Column |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | – | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | – | System Gold 128 Solvent Module HPLC |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flamable |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS |
| Loading Buffer | |||
| Luminol solution | Ge Healthcare | RPN2232 | Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit |
| Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | – | Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| Milk-blocking solution | Ristora | – | 3 % in PBS |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Nitrocellulase membrane | Ge Healthcare | 10600002 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7000 | |
| Peroxidase substrate ECL | GE Healthcare | RPN2235 | Light sensitive material |
| Pump Vacuum Press | VWR | 111400000098 | |
| Reagent A | Sigma | B9643 | Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution |
| Reagent B | Sigma | B9643 | Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Sodium metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
| Sonicator system | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz |
| Syringe | Terumo | – | |
| Transparent fixed 300-µL insert glass tubes | Thermo Scientific | 11573680 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
| Vacuum concentrator | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac System |
| Water LC-MS grade | Sigma | 39253 | |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Santoni, M., Bertini, E., Zampieri, R., Cuccurullo, A., Commisso, M., Gecchele, E., Avesani, L. Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes. J. Vis. Exp. (145), e59298, doi:10.3791/59298 (2019).