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Biology

Capacité de différenciation des cellules souches humaines aortiques périvasculaires adipeux

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59337
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Maine Medical Center Research Institute

Summary

Ce protocole vise à tester la capacité des cellules souches dérivées du tissu adipeux humain périvasculaire se différencier en plusieurs lignées cellulaires. La différenciation a été comparée à des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse humaine, qui est appelée à se différencier en adipocytes et ostéocytaires chondrocyte lignées.

Abstract

Le tissu adipeux est une source riche de multiples puissantes cellules souches mésenchymateuses (CSM) capables de différencier dans ostéogénique, adipocytaire, lignées chondrogéniques et. La différenciation adipocytaire de cellules progénitrices est un mécanisme important de conduire l’expansion du tissu adipeux et la dysfonction en réponse à l’obésité. Modifications de compréhension pour le tissu adipeux périvasculaires (TVAP) est donc cliniquement pertinentes dans les maladies métaboliques. Cependant, des études antérieures ont été principalement effectuée chez la souris et autre animaux modèles. Ce protocole utilise des échantillons TVAP thoraciques humains prélevés sur les patients subissant une coronaropathie pontage aorto-coronarien greffon. Le tissu adipeux de l’aorte ascendante a été collecté et utilisé pour l’explantation de la fraction stroma vasculaire. Nous avons déjà confirmé la présence de cellules progénitrices adipeuse dans TVAP humaine ayant la capacité de se différencier en contenant des lipides adipocytes. Dans cette étude, nous avons analysé plus loin le potentiel de différenciation des cellules de la fraction vasculaire stromale, contenant probablement des cellules progénitrices multi-puissant. Nous avons comparé les cellules TVAP dérivées de la moelle osseuse humaine MSC pour une différenciation adipocytaire, ostéogénique et chondrogéniques lignages. Après 14 jours de la différenciation, des colorants spécifiques ont été utilisés pour détecter l’accumulation de lipides dans les adipocytes (huile rouge O), des dépôts calcifiées en cellules ostéogéniques (alizarine rouge), ou de glycosaminoglycanes et de collagène dans les cellules chondrogéniques (Trichrome de Masson). Alors que la moelle osseuse MSC distingue efficacement tous les trois lignées, cellules dérivées de TVAP avaient adipocytaire et chondrogéniques potentielle, mais n’avait pas de potentiel ostéogénique robuste.

Introduction

Le tissu adipeux est une source riche de multiples puissantes cellules souches mésenchymateuses (CSM) capables de différencier dans ostéogénique, adipocytaire et chondrogéniques lignages1. Ce tissu se développe à travers une hypertrophie des adipocytes matures et de différenciation de novo du SMC résident aux adipocytes. Le tissu adipeux périvasculaires (TVAP) entoure les vaisseaux sanguins et régule la fonction vasculaire2,3. Expansion de TVAP induites par l’obésité aggrave des pathologies cardiovasculaires. Alors que le potentiel multipotent du SMC de dépôts adipeux sous-cutané humaines ont été bien étudié4,5, aucune étude ont explantées et évalué la capacité de différenciation des humains dérivés TVAP progénitrices, probables due à le pouvoir envahissant des marchés. Ainsi, l’objectif de ce travail est de fournir une méthodologie d’explantation et propager des cellules progénitrices de humaine TVAP aortique chez les patients atteints de maladies cardiovasculaires et de tester leur propension à se différencier à ostéogénique, chondrogéniques et adipocytaire lignées. Notre source de TVAP est sur le site de l’anastomose de la greffe de pontage sur l’aorte des patients obèses devant subir une chirurgie de greffe pontage artère coronaire ascendante. TVAP fraîchement isolées est enzymatiquement dissociées et la fraction stroma vasculaire est isolée et propagée in vitro, ce qui nous permet de tester pour la première fois la capacité de différenciation des cellules progénitrices de dérivés de TVAP humaine.

Utilisant primaire culture humaine TVAP stroma vasculaire fraction, nous avons testé trois tests conçus pour induire les cellules souches/progénitrices vers adipocytaire, ostéogénique, ou chondrogéniques lignages. Notre étude préalable identifié une population de CD73 +, CD105 + et PDGFRa + (CD140a) des cellules qui peuvent se différencier robuste en adipocytes6, bien que leur multipotentialité n’a pas été testée. TVAP régule directement de ton et l’inflammation vasculaire7. La raison d’être pour tester le potentiel de différenciation de cette population de cellules nouvelles doit commencer à comprendre l’influence spécialisé de TVAP sur la fonction vasculaire et les mécanismes d’expansion TVAP au cours de l’obésité. Cette méthode améliore notre compréhension des fonctions des cellules progénitrices dérivées de tissus adipeux et nous permet d’identifier et de comparer les similitudes et les différences des cellules progénitrices de sources de tissus différents. Nous inspirer des approches établies et validées pour isoler et de différencier les MSC vers différentes lignées et optimiser les procédures afin de maximiser la viabilité de cellules progénitrices de dérivés de TVAP humaine. Ces techniques ont des applications larges dans le domaine des souches et progénitrices cellule recherche et le tissu adipeux de développement.

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Protocol

L’utilisation de tissus humains dans cette étude a été évaluée et approuvée par l’institutionnel Review Board de Maine Medical Center, et tout le personnel a reçu une formation appropriée avant l’expérimentation.

1. les préparatifs

  1. Faire le tampon de dissociation en reconstituant 50μg collagénase/a animal-libre j’ai mélange solution 1 ml de solution de travail nanopure H2O. Prepare 1 mg/mL en ajoutant 49 mL d’hyperglycémie DMEM contenant 1 % w/v BSA à la collagénase reconstitué / solution de l’a. Stocker les aliquotes de travail de 5 mL à-20 ° C et chaud à 37 ° C à l’aide d’un avant de bain d’eau à utiliser.
  2. Faire une solution antibiotique en ajoutant 1 mL de solution antibiotique/antimycosiques x 100 (concentration finale est 200 unités/mL de pénicilline, 200 unités/mL de streptomycine et 0,5 µg/mL fungizone) à 49 mL de HBSS et stocker sur la glace.
  3. Préparer la solution de gélatine (0,2 % p/v) de dissoudre la gélatine de 200 mg de peau bovine dans 100 mL de nanopure H2O. Autoclave la solution pendant 20 min et conserver à 4 ° C.
  4. Préparer 500 mL de milieu de culture de TVAP : hyperglycémie DMEM/F12 avec supplément de glutamine, pyruvate de sodium et de bicarbonate de sodium, additionné de 10 % FBS et agent antimicrobien de 100 µg/mL (voir Table des matières).
  5. Préparer 50 mL de milieu d’induction adipocytaire : hyperglycémie 40,8 mL DMEM, additionné de 7,5 mL de milieu de croissance TVAP, 500 µL de 100 x solution antibiotique/antimycosique (concentration finale est de 100 unités/mL de pénicilline, 100 unités/mL de streptomycine et fungizone 0,25 µg/mL), 0,5 mM IBMX (stock de 500 mM dans NaOH 0,1 M), 1 dexaméthasone µM (stock de 1 mM dans l’éthanol), 5 µM rosiglitazone (stock 5 mM dans le DMSO), 33 biotine µM (stock 66 mM dans le DMSO), 100 nM d’insuline (200 stock µM dans l’acide acétique 0,1 %) et Acide pantothénique de 20 µM (stock 100 mM H2 O).
  6. Préparer 50 mL de médias induction contrôle la lignée adipocytaire : hyperglycémie 40,8 mL DMEM supplémenté avec 7,5 mL de milieu de croissance TVAP et 500 µL de strep-stylo (stock de x 100).
  7. Préparer 50 mL de milieu de maintenance adipocytaire : hyperglycémie 41,5 mL DMEM additionné de 7,5 mL TVAP milieux de croissance de l’étape 1.3, 500 µL strep-stylo (stock de x 100), dexaméthasone 1 µM (stock 1 mM EtOH), 33 biotine µM (stock 66 mM dans le DMSO), 100 d’insuline nM (stock 200 µM dans 0,1 % ac ETIC acide) et 20 µM d’acide pantothénique (stock 100 mM H2O).
  8. Préparer 500 mL de milieu de culture pour les lignées ostéogéniques et chondrogéniques : supplément de FBS, 1 glutamine x αMEM de forte concentration de glucose additionné de 10 % (voir la Table des matières) et 5 mL de strep-stylo (stock de x 100).
  9. Préparer 50 mL de médias de l’induction pour la lignée ostéogénique : 50 mL de milieux de croissance MSC moelle osseuse additionné de 10 dexaméthasone nM et β-glycérophosphate de 10 mM.
  10. Préparer 50 mL de médias de l’induction pour la lignée de chondrogéniques : 50 mL de milieux de croissance MSC moelle osseuse additionné de 100 nM dexaméthasone, 50 µg/mL sodium ascorbate-2-phosphate et 10 ng/mL TGFβ1. Pour les conditions ostéogéniques et chondrogéniques, les milieux de croissance basale de la moelle osseuse MSC servira les médias non-induction.

2. protocole 1 : Culture TVAP humain cellules de la Fraction stroma vasculaire

Remarque : TVAP est réséqué à partir du site de l’anastomose du greffon sur l’aorte ascendante des patients anesthésiés coronarienne bypass graft interventions. TVAP aortique est placé dans un 15 mL conique contenant 10 mL glace froide hyperglycémie DMEM F12 et transféré de la salle d’opération au laboratoire dans les 2 h de résection. TVAP aortique est mis au rebut des tissus au cours de la procédure de contournement et a été considérée comme la recherche de sujets non humains par la Commission d’examen interne du Maine Medical Center.

  1. Ce protocole est un morceau de ~ 500 mg de TVAP humaine (environ 3 x 1 x 0,5 cm3). Transfert TVAP humain frais de DMEM dans un tube conique de 50 mL contenant 25 mL de solution antibiotique. Incuber à bascule pour 20 min à 4 ° C. Lorsque la TVAP est une solution antibiotique, décongeler une partie aliquote de tampon de dissociation à 37 ° C.
  2. Ajouter 50 µL de solution antibiotique/antimycosiques 100 x dans 5 mL de tampon de dissociation et stériliser à l’aide d’une seringue-filtre de 0,22 µm. Ajouter 1 mL de solution de gélatine à 1 bien sur une plaque 24 puits. Dans une hotte à flux laminaire, utiliser une pince stérile et ciseaux transférer TVAP de la solution antibiotique à une boîte de Petri stérile. Ajouter 1 mL de tampon de dissociation préchauffé au tissu et Émincer finement les tissus ensemble dans une boue (pas de morceaux plus de ~ 2 x 2 mm2) à l’aide de la pince stérile et ciseaux de dissection.
  3. Transférer la pâte de 1 mL à 4 mL de tampon de dissociation et incuber le tube sur le côté dans un agitateur orbital préchauffé 37 ° C à 200 tr/min pendant 1 h. Après 1 h, aucune pièce de tissus visibles ne seront présents, et la solution apparaîtra comme une suspension de cellules nuageuses.
  4. Filtrer la solution à travers un tamis de cellule 70 µm placé sur un tube conique de 50 mL. Rincer le filtre avec une solution antibiotique supplémentaire 10 mL de capturer autant de cellules que possible. Pas presser de la crépine.
  5. Les cellules pendant 12 min à 300 x g dans une centrifugeuse de seau se balançant à pellets.
    Remarque : Après centrifugation, le tube est séparé en une couche supérieure grasse des adipocytes, une interphase et un culot. Le culot est la fraction vasculaire stroma contenant des cellules endothéliales, les cellules immunitaires, cellules sanguines et des cellules progénitrices.
  6. Resuspendre le culot dans 10 mL de HBSS et centrifuger pendant 5 min à 300 x g. Répétez cette étape pour un total de 2 lavages en HBSS. Après le lavage final, ne pas lyser les globules rouges. Des tentatives répétées avec plusieurs tampons disponibles sur le marché et les durées d’incubation ont conduit à des réductions marquées dans la fixation des cellules progénitrices et viabilité.
  7. Aspirer la gélatine de la plaque 24 puits. Laver délicatement le bien 1 x avec HBSS pour supprimer la gélatine non lié.
  8. Resuspendre stroma vasculaire fraction culot avec intact de globules rouges dans 1 mL de milieux de culture et de la graine sur l’enduit de gélatine bien. Ajouter FGF2 humaine (remis en suspension dans du PBS additionné de BSA 0,01 % p/v) à une concentration finale de 25 ng/mL dans le milieu de culture. Incuber 24 h à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
  9. Le lendemain, milieux de culture d’enlever et laver puits 5 x avec HBSS pour éliminer les globules rouges et les cellules mortes. Ajouter 1 ml de milieux de culture fraîche additionnée de 25 ng/mL FGF2.
  10. Modifier les médias toutes les 48 h, en veillant à compléter avec 25 ng/mL FGF2 frais chaque fois.
  11. Cellules atteignent généralement 100 % confluence 7-10 jours après l’explant ; cellules de passage puis :
    1. Aspirer la monocouche de médias et lavage de croissance 2 x 1 ml HBSS. Aspirer toutes les HBSS provenant des puits et ajouter quelques gouttes de solution de dissociation cellulaire.
    2. TAP et agiter la plaque plusieurs fois et incuber à 37 ° C, avec 5 % CO2 pendant 5 à 7 min de lever les cellules. Ajouter environ 1 mL de milieu de culture frais aux cellules individuelles et distribuer 500 µL sur 2 puits d’une plaque 24 puits, chaque conteneur milieux de croissance de 500 µL et 25 ng FGF2.
  12. Continuer à élargir les cellules humaines dérivées de TVAP comme indiqué dans l’étape précédente. Chaque passage doit être pas supérieure à une scission de 1:2. Les cellules sont repiquées 5 à 7 fois avant d’allouer pour des dosages de différenciation.

3. protocole 2 : Culture la moelle osseuse humaine MSC Colonies

Remarque : La moelle osseuse humaine MSC sont isolés comme décrit8 et stockés en tant que passage début congelés les stocks en geler médias (70 % BF 20 % basal DMEM et 10 % DMSO) à ~ 100 000 cellules/mL dans le liquide N2.

  1. Rapidement décongeler un flacon de la moelle osseuse MSC de la liquide N2 dans un bain-marie à 37 ° C et la plaque à un puits d’une plaque de 6 puits culture contenant 3 mL de milieux de culture de MSC et incuber une nuit à 37 ° C et 5 % de CO2.
  2. Le lendemain, aspirer les milieux de culture MSC et laver les cellules 3 x dans 2 mL de HBSS. Au confluent de 100 %, aspirer les milieux de culture et laver les cellules 3 x dans 2 mL de HBSS. Ajouter 500 µL/puits cellule détachement solution et incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 5 min. robinet la plaque pour s’assurer que toutes les cellules sont délogés et répartir le contenu de 2 puits d’une plaque de 6 puits contenant des milieux de culture pour le MSC 2 mL.
  3. Développez la moelle osseuse humaine et dérivés TVAP MSC en parallèle pour environ 5 à 7 passages, ou jusqu'à ce que des quantités suffisantes pour les tests ont été réalisés.

4. Protocole n° 3 : Plaque et induire adipocytaire, ostéogénique et des lignées de Chondrogéniques

  1. Réplique les numéros appropriés de la plaque de la moelle osseuse et de cellules dérivées de TVAP / puits d’une plaque de 12 puits et approprié pour chaque condition expérimentale. Pour adipocytaire et conditions ostéogéniques, ~ 200, 000 – 225 000 cellules/puits est nécessaires, pour des conditions chondrogéniques, 150 000 à 175 000 cellules/puits sont nécessaires.
    Remarque : Nous avons couru un minimum de N = 3 puits répétées pour contrôle et induit des conditions pour chaque lignée expérimentale pilotée par un total de 2 indépendants (N = totales 6 répétitions).
  2. Dissocier les cellules à la fois la population de cellules progénitrices TVAP humaine et la population de MSC de la moelle osseuse humaine en utilisant la solution de détachement cellulaire et l’incubation à 37 ° C et 5 % de CO2 pour les populations de piscine 5 min. dans deux flacons distincts 15 mL conique. Tourner le flacon vers le bas à 500 x g pendant 7 min granuler les cellules. Remettre en suspension dans 1 mL de PBS et un hémocytomètre permet d’estimer le nombre de cellules.
  3. Les cellules dans les plats de 12 puits de la plaque comme indiqué au point 4.1. Prévoir des plats séparés induit et non induite adipocytaire, ostéogénique et conditions afin que la condition non induite peut être fixée à un stade antérieur de temps sans interruption de poursuivre la culture de l’état induit.
  4. Ajouter 1,5 mL d’adipocytaire et médias induction ostéogénique dans chaque loge de la condition induite. Ajouter 1,5 mL d’adipocytaire et ostéogéniques non induction médias dans chaque loge de la condition de non induite. Commencer l’incubation de l’adipocytaire et les populations de cellules ostéogéniques d’induits et non induite à 37 ° C et 5 % de CO2.
  5. Tournez en bas le volume restant des cellules progénitrices TVAP humaines et de la moelle osseuse humaine MSCs pendant 7 min à 500 x g.
  6. Déterminer le volume nécessaire pour remettre en suspension les restants de la moelle épinière et granules cellulaires dérivées TVAP pour atteindre une densité de 100 000 cellules/10 µL (106 cellules/mL). Remettre en suspension les boulettes du volume calculé des milieux de culture MSC pour l’induction de lignage chondrogéniques. Déplacez doucement le volume des cellules et descendre à l’aide d’une pipette pour assurer une répartition homogène.
  7. Pipetter une goutte de 10 µL de la solution de cellules concentrées dans le centre de chaque puits pour former un micromass de 100 000 cellules. Placer 1 mL stérile H2O dans le puits adjacent pour éviter l’évaporation. Incuber les cultures micromass pendant 2 h à 37 ° C et 5 % de CO2 pour permettre la micromass à agréger.
  8. Après 2 heures, ajouter avec précaution les médias de différenciation chondrogéniques additionné de 10 ng/mL TGFβ1 humaine à chacun des puits induite-condition. Ajouter avec précaution 1,5 mL des médias non induction (milieux de culture MSC de la moelle osseuse) dans les puits de condition non induite. Utiliser les plaques séparées de 12 puits pour les conditions induites ou non induite afin que la condition non induite peut être fixée à un stade antérieur de temps.

5. protocole 4 : Culture adipocytaire, ostéogénique et des lignées de Chondrogéniques pendant 14 jours

  1. Les conditions induites ou non induite de tous les trois lignées de la culture pendant 4 jours à 37 ° C et 5 % CO2, rafraîchissant médias tous les 2 jours. Jour 4, changer la condition de lignée d’adipocytaire induite de médias d’induction aux médias d’entretien pour le reste de l’essai.
  2. Difficulté les conditions non induite dans du formol 10 % pendant 12 h. Dispose de formol et laver tous les fixes puits 2 x dans du PBS pour éliminer toute trace de formol. Stocker les plaques dans du PBS à 4 ° C jusqu’au traitement.
  3. Les conditions induites pour un total de 14 jours, rafraîchissant médias tous les 2 jours de culture. Ajouter TGFβ1 fraîches à 10 ng/mL concentration finale avec chaque rafraîchissement des médias chondrogéniques induction. Continuer à la culture de la lignée adipocytaire dans l’adipocytaire entretien médias et lignée ostéogénique induction, actualiser tous les 2 jours. Au jour 14, fixer des conditions tout induites pendant 12 h dans du formol 10 % pour la coloration.
  4. Grattez ou verser le micromass dans la condition chondrogéniques induit dans une cassette pour l’enrobage. Déshydrater les micromass dans une série de bains d’alcool de plus en plus concentrés pendant 5 min, commençant à 70 %, puis à 80 %, deux fois plus de 95 % et deux fois plus dans l’alcool absolu. Placez la cassette dans un agent de la désalcoolisation et ensuite enfin incorporer la cassette en cire de paraffine pour coupes et coloration.

6. protocole 5 : Coloration adipocytaire Condition avec de l’huile rouge O

  1. Préparer la solution mère Oil Red O en dissolvant 350 mg d’huile rouge O dans 100 mL d’isopropanol 100 %. Mélanger pendant 2 h avec une barre de remuer et vide à travers un filtre de 0,2 µm. Solution mère peut être stockée dans l’obscurité à température ambiante pendant 1 an.
  2. Préparer l’huile rouge O solution de travail en mélangeant 3 parties de solution mère à 2 parties diH20 (par exemple 60 mL de solution mère à 40 mL diH20). La concentration finale de Oil Red O dans la solution de travail est de 2,1 mg/mL.
  3. Retirez tout fluide de puits. Laver chaque fois bien 2 avec 60 % isopropanol, en veillant à enlever toute l’eau sur les côtés des puits. Aspirer les 60 % isopropanol et ajouter rapidement la solution de travail Oil Red O sans toucher les parois des puits pour recouvrir le fond. Il est essentiel que cette étape se faite rapidement afin de ne pas faire sécher les puits.
  4. Une fois l’huile rouge O est ajouté, incuber pendant 10 min à température ambiante avec le doux balancement.
  5. Supprimer tous les Oil Red O et ajouter immédiatement distillée H2O. Wash avec distillée H2O pour 10 m commencer à supprimer non lié o d’huile rouge. Après 10 min, aspirer l’huile rouge O et répéter la procédure de lavage 3 x.
  6. Une fois que le lavage est terminé, ajoutez PBS et les cellules de l’image. Stocker des cellules colorées dans du PBS à 4 ° C.

7. Protocole n° 6 : Coloration ostéogénique Condition d’alizarine rouge

  1. Retirez tous les fluides de chaque puits. Ajouter un volume approprié de solution à 2 % alizarine rouge tache dans chaque cupule (1,5 mL / puits d’une plaque de 12 puits) et incliner délicatement la plaque à côté jusqu'à ce que la solution couvre entièrement le fond du puits.
  2. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Enlever alizarine rouge provenant des puits. Rincer doucement chaque puits quatre fois avec distillée H2O, en veillant à ne pas déloger les cristaux de calcium. Laisser pour sécher.

8. protocole 7 : Coloration Chondrogéniques Condition avec Masson Trichrome

  1. Cuire au four de diapositives dans un four sec à 60 ° C pendant 30 min. des sections Deparaffinize et hydrate à l’eau distillée.
    1. Pour réhydrater, placer les lames dans trois des incubations 5 min avec des agents de désalcoolisation, suivies des incubations de 5 min en descendant des concentrations d’alcool comme suit : deux à 100 % (éthanol absolu), deux à 95 % d’alcool, deux à 80 %, 2 à 70 % et enfin deux en eau distillée H2O. glisse peut rester en H2O et fixateur de Bouin est prête.
  2. Place 40 mL de fixateur de Bouin dans un pot en plastique micro-ondable coplin (non couvert). Micro-ondes à puissance maximale de porter temp à 55 ° C. Placez la lame dans une solution chauffée pendant 20 min ; laisser reposer sur le comptoir couvert. Laver à l’eau courante pendant 10 min ou jusqu'à ce que toutes les couleurs jaune disparaît.
  3. Tacher les sections dans l’hématoxyline de Weigert pendant 10 min. Lavez à l’eau courante pendant 10 min.
  4. Tacher les sections dans la solution de fuchsine acide écarlate de Beibrich pendant environ 10 minutes pour laver 3 x 10 min dans l’eau du robinet. Mordant les lames dans une solution d’acide phosphotungstique/phosphomolybdique pendant 10 min. Ne pas rincer.
  5. Placer les lames directement dans une solution bleue aniline pendant 10 min. rincer avec deux trempettes brièvement dans l’eau du robinet.
  6. Placer les lames dans une solution d’acide acétique à 1 % pour 3 à 5 min. laver à l’eau du robinet pendant 1 min. Place dans l’éthanol à 95 % pendant 1 min. Dehydrate comme indiqué dans l’étape 5.4 et monter avec résine synthétique.

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Representative Results

Isolation de stroma vasculaire fraction de TVAP humaine

Figure 1 a montre une représentation schématique de la région anatomique où la TVAP recouvrant l’aorte ascendante a été obtenue. Nous avons décrit précédemment les populations de patients subissant le pontage coronarien d'où ces échantillons ont été dérivées6. Figure 1 b montre un exemple de la TVAP humaine obtenue après une intervention chirurgicale. La figure 1 montre un représentatif de TVAP tissu teinté avec colorant Trichrome de Masson. La figure 1 est une micrographie de contrat de phase présentant une population de cellules stromales dérivées de TVAP pendant la phase d’expansion avant la différenciation. Les cellules peuvent être élargies et congelés pour une utilisation future. Les cellules sont généralement congelés à une densité de 2. 5 x 105 cellules/mL dans un milieu composé de 70 % FBS, 20 % basal (antibiotique libre) DMSO DMEM F12 et 10 % dans une enceinte d’isopropanol à-80 ° C pendant 24 h et a déménagé à la phase liquide, d’un congélateur de2 N liquide pour long-t stockage de l’ERM.

Différenciation adipocytaire

Des études ont été menées en parallèle avec les dérivés de la moelle osseuse humaine MSC (Figure 2 aB) et les cellules progénitrices dérivées de TVAP (Figure 2D). Les panneaux de gauche de la Figure 2 montrent la condition non induite, où aucune accumulation de lipides n’est évidente. Les panneaux de droite montrent des cellules après différenciation adipocytaire et la coloration des lipides neutres avec huile rouge O. Alors que le degré de différenciation dans les cellules humaines de dérivés de TVAP aortiques est plus robuste, les deux sources de cellules humaines ont montré la capacité de différencier vers la lignée adipocytaire.

Différenciation ostéogénique

Le protocole de différenciation ostéogénique a été utilisé pour les MSC de moelle osseuse humaine (Figure 3 a– C) et de cellules dérivées de TVAP (Figure 3D– F). Induite par des cellules (Figure 3 aD) a fait tache pas avec le rouge d’alizarine. Après le protocole de différenciation ostéogénique, le SMC humain a développé des nodules calcifiés qui maculait d’alizarine rouge (Figure 3 b– C), tandis que les cellules humaines aortiques TVAP dérivé n’ont pas (Figure 3E– F). Ces données indiquent que notre préparation des cellules de la fraction stroma vasculaire de l’homme TVAP n’ont pas un nombre important de géniteurs avec la possibilité de subir une ostéogenèse. Selon le cours d’étude et de temps de différenciation, il est recommandé d’assurer le suivi des taches standards avec la détection de marqueurs moléculaires qui définissent l’engagement de la lignée ostéogénique (RUNX2, osterix, phosphatase alcaline) ou ostéoblastes (ostéopontine, ostéocalcine, phosphatase alcaline, BAP1).

Différenciation Chondrogéniques

Les cellules dérivées de ces deux MSC (Figure 4 a) de la moelle osseuse humaine et humaine TVAP (Figure 4 b) afficher les éléments caractéristiques de différenciation chondrogéniques, avec une accumulation de collagène abondant dans le micromass. Micromasses formés à partir de la moelle osseuse humaine MSC et de cellules d’origine TVAP aortiques présentaient aussi accumulation abondante des glycosaminoglycans (bleu) comme indiqué par coloration au bleu Alcian (Figure 4– D, respectivement). Morphologiquement, les structures semblables aux lacunes ont été détectés avec cellules assis dans les cavités autour de dépôts de collagène (Figure 4, flèches). Selon le cours de l’étude et le temps de différenciation, la détection de marqueurs spécifiques chondrogéniques (aggrecane, collagène de type II, Ostéonectine, Sox9) est utile.

Figure 1
Figure 1 : caractéristiques morphologiques des humain TVAP. (A) représentation de l’aorte humaine (rouge) avec entourant TVAP (jaune) de dessin animé. La flèche indique aorte ascendante. (B), une pièce de 480 mg de humaine TVAP aortique chez un patient de CABG en DMEM avant la dissociation. Coloration trichrome de Masson (C) de fixés au formol paraffine humaine TVAP (brun foncé/noir = noyaux, bleu/violet = du tissu conjonctif, Rose = cytoplasme ; Note, RBC figurent rose rougeâtre. (D) l’image représentative des explantés cellules TVAP-stromal à 7 jours de culture. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : différenciation adipocytaire. Phase (A) de la moelle osseuse humaine MSC dans la condition non induites par la microscopie ne montre aucun signe de différenciation. (B) microscopie de Phase de la moelle osseuse humaine MSC dans la condition adipocytaire induit montre une différenciation et immobilisation de lipides neutres, colorées avec de l’huile rouge O après 14 jours. (C) Phase microscopie des cellules humaines de dérivés de TVAP aortiques dans la condition non induite adipocytaire ne montre aucun signe de différenciation. (D) microscopie de Phase de cellules humaines de dérivés de TVAP aortiques dans la condition adipocytaire induit montre robuste différenciation et immobilisation de lipides neutres, colorées avec de l’huile rouge O après 14 jours. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Différenciation ostéogénique. (A) Phase examen au microscope de la moelle osseuse humaine MSC dans la condition ostéogénique non induite ne montre aucun signe de différenciation vers une lignée ostéogénique. Phase (B) microscopie de la moelle osseuse humaine MSC dans la condition induite après 14 jours de culture montre une différenciation et la formation de dépôts de calcium colorées au rouge d’alizarine (flèches). (C) une image de la cupule contenant la moelle osseuse humaine MSC dans la condition ostéogénique induite après coloration avec l’alizarine rouge indique le dépôt de calcium abondante, ce qui suggère une différenciation réussie vers une lignée ostéogénique (flèches, dépôt de calcium). (D) Phase microscopie des cellules de dérivé de TVAP aortiques humaines dans la condition ostéogénique induite par des pièces sans indication de différenciation vers une lignée ostéogénique. Phase (E) microscopie des cellules de dérivés de TVAP aortiques humaines dans la condition ostéogénique induite après 14 jours de culture montre aucun signe de différenciation vers une lignée ostéogénique ou de dépôts de calcium lorsqu’elle est colorée de rouge d’alizarine, seulement coloration non spécifique. (F) une image de la cupule contenant les cellules humaines de dérivés de TVAP aortiques dans la condition ostéogénique induite suivant coloration avec l’alizarine rouge montre seulement non spécifiques de coloration. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : La différenciation Chondrogéniques. (A, B) Microscopie d’une section de la micromass formé par MSC (A) de la moelle osseuse humaine ou TVAP aortique humain cellules progénitrices (B) dans la condition de chondrogéniques induite après 14 jours de culture et par la suite colorées avec Trichrome de Masson, qui indique significative les dépôts de collagène (bleu) et suggère une différenciation réussie vers une lignée chondrogéniques. (C, D) Microscopie d’une section de la micromass formé par MSC (C) de la moelle osseuse humaine ou TVAP aortique humaine des cellules progénitrices (D) dans la condition de chondrogéniques induite après 14 jours de culture et ensuite colorés avec Alcian bleu, qui indique les dépôts d’acide protéoglycanes (p. ex. les glycosaminoglycanes) comme se trouvent généralement dans le cartilage. Contre-colorant, nucléaire rapide rouge ; flèches, structures ressemblant à des lacunes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Adipeuse progéniteurs de différents dépôts varient largement en phénotype et différenciation potentiels9. Culture des progéniteurs TVAP dérivés provenant d’un donneur unique patient à induction simultanée vers le bas de trois lignées différentes, adipocytaire, ostéogénique et chondrogéniques, permet une étude bien contrôlée des capacités pluripotentes de ce roman population de cellules progénitrices. La méthodologie décrite dans le présent rapport peut être utilisée pour tester la capacité de différenciation des cellules progénitrices de TVAP humain et de comprendre leur fonction dans la régulation du tonus vasculaire et pathologies TVAP. Certains avantages de cette technique sont sa simplicité et utilisation de tissus humains primaires de l’artère coronaire contourner les patients, ce qui permet l’étude de la fonction des cellules progénitrices TVAP provenant de patients atteints de graves maladies cardiovasculaires. Toutefois, les explants d’une pièce de 500 mg de tissu généralement céder < 1000 adhérentes cellules et nécessitent donc des passages de 5 à 7 pour obtenir un nombre suffisant, mettant en évidence une importante mise en garde à cette approche. Essentielle au succès des expériences différenciation tri-lignée est la qualité de l’explant initial de cellules du donneur TVAP. Il est essentiel pour Émincer finement le tissu avant la dissociation enzymatique. En outre, contrairement aux autres protocoles de l’explant, nous avons constaté une perte dramatique du nombre de cellules, la viabilité et la qualité globale lorsque le tampon de lyse des globules rouges a été utilisé avant la culture. Au lieu de cela, il est fortement recommandé pour la plaque de la fraction de vasculaire stromale entière (y compris les globules rouges). Après 24h, cellules adhérentes vont avez attaché et non lysées globules rouges peut être enlevés par des lavages répétés avec HBSS. Passage des cellules stromales dérivées de TVAP doit être pas plu de 1:2 divisions. Nous avons observé une réduction des taux de croissance lorsque les cellules étaient fendus 1:3 ou supérieur.

Le composant le plus difficile du test de différenciation de le trilineage est la condition de chondrogéniques, car elle exige une méthode moins courante de culture de cellules dans un « micromass » et histologique d’enrobage et de sectionnement. Il faut à la plaque correctement la goutte de 10 µL de 100 000 cellules et ne perturbe pas la masse sur l’ajout de milieu de culture. Nous avons constaté des variations entre essais quant à agglomérés les micromass est resté collé à la plaque ou en suspension dans le milieu. Même lorsque la masse ne sont pas restés collée, la viabilité de structure et cellule micromass est resté stable.

Des cellules souches ou progénitrices dans le microenvironnement vasculaire sont responsables de la réparation des tissus suite à une blessure ou une maladie. Plus bien caractérisés sont les populations qui en dérivent des compartiments pericyte/adventitiels, bien qu’il y a encore des controverses pour savoir si il y a une identification moléculaire normalisée de ces populations dans les humains10,11 . Dans ce protocole, nous étudions une population de cellules progénitrices dérivée spécifiquement humain TVAP pour tester leur propension à faire la différence à une lignée ostéogénique, chondrogéniques ou adipocytaire. L’utilisation de techniques de coloration pour définir chaque lignée cellulaire engagement, nous démontrons que contrairement à la CSM de moelle osseuse humaine, cellules progénitrices de TVAP humaine n’ont pas pu différencier vers une lignée ostéogénique (Figure 3) mais présentent une robuste différenciation adipocytaire. La capacité de différenciation chondrogéniques est comparable entre la moelle osseuse et de cellules dérivées de TVAP. Ceci suggère que les cellules souches dérivées de TVAP pourraient être lignée plus restreinte que la moelle osseuse MSC ou que les progéniteurs TVAP ne distinguent pas facilement en lignées ostéogéniques. Futures études devraient inclure une enquête de l’expression génique et protéique des marqueurs pour chaque lignée d’évaluer plus quantitativement la capacité de différenciation des cellules dérivées de TVAP.

Cellules souches dérivées d’adipeux ont été au centre des applications en médecine régénérative, en raison d’un accès facile et le nombre élevé de cellules pouvant être dérivées du tissu adipeux12,13. Au sein de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux, il y a des cellules vasculaires, des cellules inflammatoires, fibroblastes, préadipocytes et adipeux dérivées de cellules souches. Il y a des différences dans la population de cellules souches basés sur la localisation anatomique du tissu adipeux depot et adipocyte caractéristiques14. Surtout, il semble que les cellules souches dérivées d’adipeux ont la capacité non seulement de se différencier en lignées mésenchymateuses15, mais aussi le potentiel d’adopter neuronale16,17 et épidermiques18 destins.

De nombreuses études ont mis l’accent sur les cellules souches/progénitrices dérivées de tissus adipeux humains blancs sous-cutanée, mais très peu d’études ont abordé les caractéristiques des populations progénitrices TVAP. Des études récentes ont isolé des cellules progénitrices adipocyte de vaisseaux mésentériques avoisinants TVAP ou aorte thoracique du rat. Ces CD34 + / CD140a + les populations se différenciées en adipocytes, bien que la capacité à tirer des autres lignées n’a pas été testé19.

Nous avons caractérisé récemment progéniteurs adipeuse, dérivés de la fraction stroma vasculaire de TVAP humain provenant de patients atteints de maladie coronarienne avancée6. Ces cellules souches adipeuses étaient CD73 +, CD105 + et CD140a + et efficacement se différencient en adipocytes avec caractéristiques thermogénique (expression UCP1)6. Dans les travaux en cours, nous avons trouvé une activité limitée lignée des cellules dérivées de TVAP par rapport aux dérivés de la moelle osseuse MSC, suggérant un manque ou une population minimale des cellules souches dérivées d’adipeux qui ont été caractérisées d’autres tissus adipeux humains. Un examen de ce protocole est la variabilité attendue entre les prélèvements humains, qui peut affecter le nombre de cellules souches/progénitrices au sein de l’échantillon de TVAP et leur capacité à subissent une différenciation de lignées distinctes. Âge, sexe, IMC, médicaments et autres paramètres cliniques probables influent sur le phénotype des cellules progénitrices dans TVAP. Ainsi, attendue de futures modifications du présent protocole attendent une population progénitrices clairement définis plus au sein de TVAP humaine et éventuellement à l’aide de tri cellulaire pour isoler certaines sous-populations d’études de la lignée.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous reconnaissons l’aide de la Navigation de recherche au centre médical de Maine pour aider avec l’achat de tissus cliniques et l’histopathologie et Histomorphométrie Core (pris en charge par 1P20GM121301, L. Leblanc PI) au Maine Medical Research Center Institut de coupes et de coloration. Ce travail a été soutenu par les NIH accorder R01 HL141149 (L. Leblanc).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I   Millipore-Sigma SCR139 50mg
Alcian Blue NewComerSupply 1003A 1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red Amresco 9436-25G
alpha-MEM ThermoFisher 12561056
Aniline Blue NewComerSupply 10073C
Antibiotic/antimycotic ThermoFisher 15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin Millipore-Sigma A3908-25G
b-glycerophosphate Millipore-Sigma G9422-10G
Biebrich Scarlet EKI 2248-25G
Biotin Millipore-Sigma B4501-100MG
Bouin's fixative NewComerSupply 1020A
Bovine serum albumin Calbiochem 12659 stored at 4 °C
Cell detachment solution Accutase AT104
Bell strainer (70 mm) Corning 352350
Dexamethasone Millipore-Sigma D4902-100MG
DMEM Corning 10-013-CV 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium ThermoFisher 10565-042 high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO Millipore-Sigma D2650
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals  S11550
FGF2 Peprotech 100-18B
Formalin NewComerSupply 1090
Gelatin, bovine skin Millipore-Sigma G9391-500G
Glutamax ThermoFisher 35050061 glutamine supplement
HBSS Lonza 10-547F
IBMX Millipore-Sigma I5879-250MG
Insulin solution Millipore-Sigma I9278-5ML
Oil red O Millipore-Sigma O0625-100G
Pantothenic acid Millipore-Sigma P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution ThermoFisher 15240062 100ml
Permount Fisher SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution Millipore-Sigma P4006-100G/221856-100G
Primocin Invivogen ant-pm-1 Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone Millipore-Sigma R2408-10MG
TGFb1 Peprotech 100-21
Weigert's hematoxylin EKI 4880-100G

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References

  1. Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
  2. Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
  3. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  4. Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. Differentiation of adipose stem cells. Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).
  5. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  6. Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
  7. Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
  8. Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
  9. Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
  10. de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
  11. Majesky, M. W. Adventitia and perivascular cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).
  12. Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
  13. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  14. Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
  15. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  16. Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
  17. Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
  18. Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
  19. Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).

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Biologie numéro 145 tissu adipeux humain périvasculaires cellules progénitrices adipeuse des cellules souches mésenchymateuses chondrogenèse ostéogenèse adipogénèse différenciation cellulaire les maladies cardiovasculaires
Capacité de différenciation des cellules souches humaines aortiques périvasculaires adipeux
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Scott, S. S., Yang, X., Robich, M., Liaw, L., Boucher, J. M. Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (145), e59337, doi:10.3791/59337 (2019).

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