Procedura operativa standard per la sorveglianza lyssavirus della popolazione bat a Taiwan
Summary
Questo protocollo introduce una procedura operativa di laboratorio standard per il test diagnostico degli antigeni lyssavirus nei pipistrelli a Taiwan.
Abstract
I virus all’interno del genere Lyssavirus sono patogeni zoonotici, e almeno sette specie di lyssavirus sono associati a casi umani. Poiché i pipistrelli sono serbatoi naturali della maggior parte dei lissavirus, un programma di sorveglianza del lyssavirus di pipistrelli è stato condotto a Taiwan dal 2008 per capire l’ecologia di questi virus nei pipistrelli. In questo programma, organizzazioni non governative di conservazione dei pipistrelli e centri locali di controllo delle malattie animali hanno collaborato per raccogliere pipistrelli morti o pipistrelli che muoiono di debolezza o malattia. I tessuti cerebrali dei pipistrelli sono stati ottenuti attraverso necroscopia e sottoposti a test anticorpali fluorescenti diretti (FAT) e reazione a catena di trascrizione inversa (RT-PCR) per il rilevamento di antigeni lissavirus e acidi nucleici. Per il FAT, si raccomandano almeno due diverse diagnosi di rabbia. Per la RT-PCR, due serie di primer (JW12/N165-146, N113F/N304R) vengono utilizzati per amplificare una sequenza parziale del gene della nucleovirusproteina della lissa. Questo programma di sorveglianza monitora i lyssavirus e altri agenti zoonotici nei pipistrelli. Il lissavirus pipistreavirus di Taiwan si trova in due casi di pipistrelle giapponese (Pipistrellus abramus) nel 2016-2017. Questi risultati dovrebbero informare il pubblico, gli operatori sanitari e gli scienziati sui potenziali rischi di contattare pipistrelli e altri animali selvatici.
Introduction
I virus all’interno del genere Lyssavirus sono patogeni zoonotici. Ci sono almeno sette specie di lyssavirus associate a casi umani1. Oltre alle 16 specie di questo genere1,2,3, Taiwan pipistrello lyssavirus (TWBLV)4 e Kotalahti pipistrello lyssavirus5 sono stati recentemente identificati in pipistrelli, ma i loro stati tassonomici devono ancora essere determinato.
I pipistrelli sono i padroni naturali della maggior parte dei lissavirus, con l’eccezione di Mokola lyssavirus e Ikoma lyssavirus, che non sono ancora stati identificati in alcun pipistrelli1,2,3,6. Le informazioni sui lyssavirus nei pipistrelli asiatici sono ancora limitate. Due lissavirus non caratterizzati in pipistrelli asiatici (uno in India e l’altro in Thailandia)7,8 sono stati segnalati. Un caso di rabbia umana associato a un morso di pipistrello in Cina è stato segnalato nel 2002, ma la diagnosi è stata fatta solo dall’osservazione clinica9. In Asia centrale, Aravan lyssavirus è stato identificato nel pipistrello dalle ere di topo minore (Myotis blythi) in Kirghizistan nel 1991, e Khujand lyssavirus è stato identificato nel pipistrello baffi (Myotis mystacinus) in Tagikistan nel 200110. In Asia meridionale, Gannoruwa pipistrello lyssavirus è stato identificato nella volpe volante indiana (Pteropus medius) in Sri Lanka nel 20153. Nel sud-est asiatico, diversi studi sierologici sui pipistrelli nelle Filippine, Thailandia, Bangladesh, Cambogia e Vietnam hanno mostrato una sieroprevalence variabile11,12,13,14, 15. Anche se Irkut lyssavirus è stato identificato nel pipistrello dal muso tubolare maggiore (Murina leucogaster) nella provincia di Jilin, Cina nel 201216, le specie e le posizioni esatte dei lissavirus nelle popolazioni di pipistrelli dell’Asia orientale rimangono sconosciute.
Per valutare la presenza di lyssavirus nelle popolazioni taiwanesi di pipistrelli, è stato avviato un programma di sorveglianza che impiega sia il FAT diretto che il RT-PCR. Il lissavirus pipistreavirus di Taiwan è stato identificato in due casi di pipistrelle giapponese (Pipistrellus abramus)4 nel 2016-2017. Nel presente articolo, viene introdotta una procedura operativa standard di laboratorio per la sorveglianza del virus lissavirus della popolazione di pipistrelli a Taiwan. Il diagramma di flusso della diagnosi di bat lyssavirus nel nostro laboratorio è presentato in Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa procedura operativa standard di laboratorio (SOP) fornisce un processo seriale per testare campioni di pipistrelli per la presenza di antigeni lyssavirus a Taiwan. I passaggi chiave includono l’impiego di FAT e RT-PCR. Anche la selezione di campioni adatti e l’isolamento di successo del virus sono importanti. Inoltre, alcuni problemi è stata condotta durante il monitoraggio dei lissavirus pipistrello. La differenza principale era l’animale bersaglio. Inizialmente (2008-2009), gli animali bersaglio della sorveglia…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai e Ya-Lan Li per la loro assistenza durante questo studio. Questo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione n. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) del Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture, Executive Yuan, Taiwan.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trppsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trppsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
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