대만 박쥐 인구의 Lyssavirus 감시를위한 표준 운영 절차
Summary
이 프로토콜은 대만의 박쥐에서 lyssavirus 항원의 진단 테스트를위한 표준 실험실 운영 절차를 소개합니다.
Abstract
속 Lyssavirus 내의 바이러스는 동물성 병원체이고, 적어도 7개의 lyssavirus 종은 인간적인 케이스와 연관됩니다. 박쥐는 대부분의 lyssaviruses의 자연 저수지이기 때문에, 박쥐의 lyssavirus 감시 프로그램은 박쥐에 있는 이 바이러스의 생태를 이해하기 위하여 2008년부터 대만에서 실시되었습니다. 이 프로그램에서는 비정부 박쥐 보호 단체와 지역 동물 질병 통제 센터가 협력하여 약점이나 질병으로 죽어가는 죽은 박쥐 나 박쥐를 수집했습니다. 박쥐의 뇌 조직은 부검을 통해 수득되었고, 용해바이러스 항원 및 핵산의 검출을 위해 직접 형광 항체 검사(FAT) 및 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 실시하였다. FAT를 위해, 적어도 2개의 다른 광견병 진단 접합관이 추천됩니다. RT-PCR의 경우, 두 세트의 프라이머(JW12/N165-146, N113F/N304R)가 용이사바이러스 핵단백질 유전자의 부분 서열을 증폭시키는 데 사용된다. 이 감시 프로그램은 박쥐에서 lyssaviruses 및 기타 동물 성 에이전트를 모니터링합니다. 대만 박쥐 리사바이러스는 2016-2017년 일본 피피스트렐(Pipistrellusabramus)의두 사례에서 발견된다. 이 사실 인정은 박쥐 및 그밖 야생 동물을 접촉의 잠재적인 리스크의 대중, 건강 전문가 및 과학자를 알려야 합니다.
Introduction
속 Lyssavirus 내의 바이러스는 동물성 병원체입니다. 인간 케이스와 관련되었던 적어도 7개의 lyssavirus 종이있습니다1. 이 속의 16 종 이외에1,2,3,대만 박쥐 리사 바이러스 (TWBLV)4 및 코탈라티 박쥐 리사 바이러스5 최근 박쥐에서 확인 되었습니다., 하지만 그들의 분류 학적 상태는 아직 결정됩니다.
박쥐는 모콜라 리사 바이러스와 이코마 리사 바이러스를 제외하고 대부분의 리사 바이러스의 자연 숙주이며, 아직 박쥐1,2,3,6에서확인되지 않았습니다. 아시아 박쥐의 lyssaviruses에 대한 정보는 여전히 제한되어 있습니다. 아시아 박쥐 (인도와 태국에서 다른 하나)에서 두 개의 특성이없는 lyssaviruses7,8이보고되었습니다. 2002년에 중국에서 박쥐물린과 관련된 한 인간의 광견병 사례가 보고되었지만, 진단은 임상 관찰9에의해서만 이루어졌다. 중앙아시아에서는 1991년 키르기스스탄의 작은 쥐귀박쥐(Myotis blythi)에서아라반 리사바이러스가 확인되었고, 쿠자드 리사바이러스는 2001년 타지키스탄에서 수염박쥐(Myotismystacinus)에서확인되었다. 남아시아에서는 2015년 스리랑카의 인도 비행 여우(Pteropusmedius)에서간노루와 박쥐 리사바이러스가 확인되었다 3. 동남 아시아에서, 필리핀, 태국, 방글라데시, 캄보디아, 베트남에서 박쥐에 대한 여러 혈청학 연구는 가변 혈청 11,12,13,14, 15. 이르쿠트 리사바이러스는 2012년 중국 지린성에서 더 큰 튜브코가트(Murinaleucogaster)에서확인되었지만, 동아시아 박쥐 집단의 정확한 종과 위치는 아직 알려지지 않았다.
대만 박쥐 인구에 있는 lyssavirus의 존재를 평가하기 위하여는, 직접 FAT와 RT-PCR를 둘 다 채택한 감시 프로그램이 시작되었습니다. 대만 박쥐 리사바이러스는 2016~2017년 일본 피피스트렐(Pipistrellusabramus)4의 두 사례에서 확인되었다. 본 기사에서는 대만의 박쥐 인구의 lyssavirus 감시를 위해 실험실 표준 운영 절차가 도입되었습니다. 우리의 실험실에서 박쥐 lyssavirus 진단의 흐름도는 그림1에 제시되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 실험실 표준 작동 절차 (SOP)는 대만에서 lyssavirus 항원의 존재에 대한 박쥐 샘플을 테스트하기위한 직렬 프로세스를 제공합니다. 주요 단계는 FAT 및 RT-PCR의 고용을 포함한다. 적합한 샘플의 선택과 바이러스의 성공적인 격리도 중요합니다. 또한 박쥐 라사바이러스를 모니터링하는 동안 일부 트러블슈팅이 수행되었습니다. 가장 큰 차이점은 대상 동물이었다. 처음에 (2008-2009), 박쥐 lyssavirus 감시?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구에서 티엔청 리, 이탕 린, 치아정 차이, 야란 리에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 보조금 번호에 의해 지원되었다 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) 동물 및 식물 건강 검사 및 검역국에서, 농업위원회, 집행 위안, 대만.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trppsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trppsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
Riferimenti
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