Summary

Procédure d'exploitation standard pour la surveillance du Lyssavirus de la population de chauves-souris à Taiwan

Published: August 27, 2019
doi:

Summary

Ce protocole introduit une procédure d’exploitation de laboratoire standard pour l’essai diagnostique des antigènes de lyssavirus dans les chauves-souris à Taiwan.

Abstract

Les virus du genre Lyssavirus sont des agents pathogènes zoonotiques, et au moins sept espèces de lyssavirus sont associées à des cas humains. Parce que les chauves-souris sont des réservoirs naturels de la plupart des lyssavirus, un programme de surveillance du lyssavirus des chauves-souris a été menée à Taiwan depuis 2008 pour comprendre l’écologie de ces virus chez les chauves-souris. Dans le le but, des organisations non gouvernementales de conservation des chauves-souris et des centres locaux de lutte contre les maladies animales ont coopéré pour recueillir les chauves-souris mortes ou les chauves-souris qui meurent de faiblesse ou de maladie. Les tissus cérébraux des chauves-souris ont été obtenus par autopsie et soumis à l’essai fluorescent direct d’anticorps (FAT) et à la réaction en chaîne de polymère de transcription inverse (RT-PCR) pour la détection des antigènes de lyssavirus et des acides nucléiques. Pour la FAT, au moins deux conjugués différents de diagnostic de rage sont recommandés. Pour le RT-PCR, deux ensembles d’amorces (JW12/N165-146, N113F/N304R) sont utilisés pour amplifier une séquence partielle du gène nucléoprotéine de lyssavirus. Ce programme de surveillance surveille les lyssavirus et autres agents zoonotiques chez les chauves-souris. Taiwan bat lyssavirus est trouvé dans deux cas de la pipistrelle japonaise (Pipistrellus abramus) en 2016-2017. Ces résultats devraient informer le public, les professionnels de la santé et les scientifiques des risques potentiels de communiquer avec les chauves-souris et d’autres espèces sauvages.

Introduction

Les virus du genre Lyssavirus sont des agents pathogènes zoonotiques. Il existe au moins sept espèces de lyssavirus associées à des cas humains1. En plus des 16 espèces de ce genre1,2,3, Taiwan chauve-souris lyssavirus (TWBLV)4 et Kotalahti chauve-souris lyssavirus5 ont été récemment identifiés chez les chauves-souris, mais leurs statuts taxonomiques n’ont pas encore être déterminés.

Les chauves-souris sont les hôtes naturels de la plupart des lyssavirus, à l’exception de Mokola lyssavirus et Ikoma lyssavirus, qui n’ont pas encore été identifiés chez les chauves-souris1,2,3,6. L’information sur les lyssavirus chez les chauves-souris asiatiques est encore limitée. Deux lyssavirus non caractérisés chez les chauves-souris asiatiques (l’un en Inde et l’autre en Thaïlande)7,8 ont été signalés. Un cas de rage humaine associé à une morsure de chauve-souris en Chine a été rapporté en 2002, mais le diagnostic a été fait seulement par observation clinique9. En Asie centrale, aravan lyssavirus a été identifié dans la chauve-souris à oreilles de souris inférieure (Myotis blythi) au Kirghizistan en 1991, et Le lyssavirus de Khujand a été identifié dans la chauve-souris moustachue (Myotis mystacinus) au Tadjikistan en 200110. En Asie du Sud, Gannoruwa bat lyssavirus a été identifié chez le renard volant indien (Pteropus medius) au Sri Lanka en 20153. En Asie du Sud-Est, plusieurs études sérologiques sur les chauves-souris aux Philippines, en Thaïlande, au Bangladesh, au Cambodge et au Vietnam ont montré une séroprévalence variable11,12,13,14, 15. Bien que le lyssavirus d’Irk a été identifié dans la plus grande chauve-souris à nez tubulaire (Murina leucogaster) dans la province de Jilin, Chine en 201216, l’espèce exacte et l’emplacement des lyssavirus dans les populations de chauves-souris d’Asie de l’Est restent inconnus.

Pour évaluer la présence de lyssavirus dans les populations de chauves-souris taïwanaises, un programme de surveillance utilisant à la fois la FAT directe et le RT-PCR a été lancé. Taiwan bat lyssavirus a été identifié dans deux cas de pipistrelle japonaise (Pipistrellus abramus)4 en 2016-2017. Dans le présent article, une procédure d’opération standard de laboratoire est introduite pour la surveillance de lyssavirus de la population de chauves-souris à Taiwan. Le diagramme de flux du diagnostic de lyssavirus de chauve-souris dans notre laboratoire est présenté dans la figure 1.

Protocol

1. Précautions de sécurité lors de la manipulation des lyssavirus Veiller à ce que tous les travailleurs de laboratoire qui manipulent des échantillons de chauves-souris reçoivent une prophylaxie antirabique pré-exposition17. Surveiller les niveaux d’anticorps antirabiques des travailleurs à l’avance et les réexaminer tous les 6 mois17. La vaccination de suivi contre la rage est nécessaire pour ceux dont les niveaux d’anticorps sont inférieurs à 0,5 UI…

Representative Results

De 2014 à mai 2017, 332 carcasses de chauves-souris de 13 espèces ont été recueillies pour surveillance. Deux ont été testés positifs. Dans le premier cas de chauve-souris, l’impression cérébrale a donné un résultat négatif à l’aide du FAT avec l’un des anticorps antirabiques conjugués au FITC (figure 2), tandis que les RT-PCR employant chacun des deux ensembles d’amorces (JW12/N165-146, N113F/N304R) ont donné résultats positifs (figure 3). Une s…

Discussion

Cette procédure d’exploitation standard de laboratoire (SOP) fournit un processus de série pour tester des échantillons de chauve-souris pour la présence d’antigènes de lyssavirus à Taiwan. Les principales étapes comprennent l’emploi de FAT et RT-PCR. La sélection d’échantillons appropriés et l’isolement réussi du virus sont également importants. En outre, un certain dépannage a été effectué pendant la surveillance des lyssavirus chauves-souris. La principale différence était les animaux cibles. Initial…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai et Ya-Lan Li pour leur aide au cours de cette étude. Cette étude a été appuyée par la subvention no 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) du Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture, Executive Yuan, Taiwan.

Materials

2.5% Trypsin (10x) Gibco 15090046 Trppsin
25 cm2 flask Greiner bio-one 690160
Acetone Honeywell 32201-1L
Agarose I VWR Life Science 97062-250
Alcohol NIHON SHIYAKU REAGENT NS-32294
AMV Reverse Transcriptase Promega M5101
Antibiotic-Antimycotic(100X)  Gibco 15240-062 MEM-10
Blade Braun BA215
Centrifuge eppendorf 5424R
Chemilumineance system TOP BIO CO. MGIS-21-C2-1M
Collection tube Qiagen 990381
Collection tube SSI 2341-SO
Cover slide Muto Pure chemical Co., LTD. 24505
DNA analyzer Applied Biosystems 3700XL
Fetal bovine serum Gibco 10437028 MEM-10
FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin Fujirebio Diagnostic Inc. 800-092 FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B
Four-well Teflon-coating glass slide Thermo Fisher Scientific 30-86H-WHITE
Gel Electrophoresis System Major Science MJ-105-R
HBSS (1x) Gibco 14175095 Trppsin
Incubator ASTEC SCA-165DS
Inverted Microscope Olympus IX71
L-Glutamine 200 mM (100x) Gibco A2916801 MEM-10
LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent EMD Millipore Corporation 5100 FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A
MagNA Pure Compact Instrument Roche 03731146001
MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 Roche 03730964001
MEM (10x) Gibco 11430030 MEM-10
MEM NEAA (100x) Gibco 11140050 MEM-10
MEM vitamin solution Gibco 11120052 MEM-10
NaHCO3 Merck 1.06329.0500 MEM-10
Needle Terumo NN*2332R9
PBS Medicago 09-8912-100
Primer synthesis Mission Biotech
RNasin ribonuclease inhibitor Promega N2111
Sequencing service Mission Biotech
Slide Thermo Scientific AA00008032E00MNT10
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco 11360070 MEM-10
Stainless Steel Beads QIAGEN 69989
Sterile absorbent pad 3M 1604T-2
Syringe filter Nalgene 171-0045
Taq polymerase JMR Holdings JMR-801
Thermal cycler Applied Biosystems 2720
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tongue depressor HONJER CO., LTD. 122246
Tweezer Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. A0601
Tylosin Tartrate Sigma T6271-10G MEM-10

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Citazione di questo articolo
Hsu, W., Hsu, C., Tu, Y., Chang, J., Tsai, K., Lee, F., Hu, S. Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan. J. Vis. Exp. (150), e59421, doi:10.3791/59421 (2019).

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