Standard-Betriebsverfahren für Lyssavirus-Überwachung der Fledermauspopulation in Taiwan
Summary
Dieses Protokoll führt ein Standard-Labor-Betriebsverfahren für diagnostische Tests von Lyssavirus-Antigenen bei Fledermäusen in Taiwan.
Abstract
Viren innerhalb der Gattung Lyssavirus sind zoonotische Krankheitserreger, und mindestens sieben Lyssavirus-Arten sind mit menschlichen Fällen in Verbindung gebracht. Da Fledermäuse sind natürliche Reservoirs der meisten Lyssaviren, ein Lyssavirus-Überwachungsprogramm von Fledermäusen wurde in Taiwan seit 2008 durchgeführt, um die Ökologie dieser Viren bei Fledermäusen zu verstehen. In diesem Programm, nicht-staatliche Fledermaus-Schutz-Organisationen und lokale Tierseuchen-Kontrollzentren kooperierten, um tote Fledermäuse oder Fledermäuse sterben an Schwäche oder Krankheit zu sammeln. Gehirngewebe von Fledermäusen wurden durch Nekropsie erhalten und einem direkten fluoreszierenden Antikörpertest (FAT) und Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zum Nachweis von Lyssavirus-Antigenen und Nukleinsäuren unterzogen. Für die FAT werden mindestens zwei verschiedene Tollwut-Diagnosekonjugate empfohlen. Für die RT-PCR werden zwei Primersätze (JW12/N165-146, N113F/N304R) verwendet, um eine Teilsequenz des Lyssavirus-Nukleoprotein-Gens zu verstärken. Dieses Überwachungsprogramm überwacht Lyssaviren und andere Zoonoseerreger bei Fledermäusen. Taiwan Fledermaus Lyssavirus ist in zwei Fällen der japanischen Pipistrelle gefunden (Pipistrellus abramus) in 2016–2017. Diese Ergebnisse sollten die Öffentlichkeit, Gesundheitsfachleute und Wissenschaftler über die potenziellen Risiken der Kontaktaufnahme mit Fledermäusen und anderen Wildtieren informieren.
Introduction
Viren der Gattung Lyssavirus sind zoonotische Krankheitserreger. Es gibt mindestens sieben Lyssavirus-Arten, die mit menschlichen Fällen in Verbindung gebracht werden1. Zusätzlich zu den 16 Arten in dieser Gattung1,2,3, Taiwan Fledermaus Lyssavirus (TWBLV)4 und Kotalahti Fledermaus Lyssavirus5 wurden vor kurzem in Fledermäusen identifiziert, aber ihre taxonomischen Status haben noch nicht bestimmt werden.
Fledermäuse sind die natürlichen Wirte der meisten Lyssaviren, mit Ausnahme von Mokola Lyssavirus und Ikoma Lyssavirus, die noch nicht in irgendwelchen Fledermäusen identifiziert wurden1,2,3,6. Die Informationen über Lyssaviren bei asiatischen Fledermäusen sind immer noch begrenzt. Zwei nicht charakterisierte Lyssaviren bei asiatischen Fledermäusen (eines in Indien und das andere in Thailand)7,8 wurden berichtet. Ein menschlicher Tollwut-Fall im Zusammenhang mit einem Fledermausbiss in China wurde im Jahr 2002 berichtet, aber die Diagnose wurde nur durch klinische Beobachtung9gemacht. In Zentralasien wurde Das Aravan-Lyssavirus 1991 in Der weniger mausohrohrigen Fledermaus (Myotis blythi) in Kirgisistan und das Khujand-Lyssavirus in der Schnurrbartfledermaus (Myotis mystacinus) in Tadschikistan im Jahr 2001 10 identifiziert. In Südasien, Gannoruwa Fledermaus Lyssavirus wurde in der indischen Fliegenfuchs (Pteropus medius) in Sri Lanka im Jahr 2015identifiziert 3. In Südostasien zeigten mehrere serologische Studien an Fledermäusen auf den Philippinen, Thailand, Bangladesch, Kambodscha und Vietnam eine variable Seroprävalenz11,12,13,14, 15. Obwohl Irkut Lyssavirus in der größeren Röhrennasenfledermaus (Murina leucogaster) in der Provinz Jilin, China im Jahr 201216identifiziert wurde, bleiben die genauen Arten und Standorte von Lyssaviren in ostasiatischen Fledermauspopulationen unbekannt.
Um das Vorhandensein von Lyssavirus in taiwanesischen Fledermauspopulationen zu bewerten, wurde ein Überwachungsprogramm mit direkter FAT und RT-PCR initiiert. Taiwan Fledermaus Lyssavirus wurde in zwei Fällen der japanischen Pipistrelle identifiziert (Pipistrellus abramus)4 in 2016–2017. In diesem Artikel wird ein Laborstandard-Betriebsverfahren für die Lyssavirus-Überwachung der Fledermauspopulation in Taiwan eingeführt. Das Flussdiagramm der Fledermauslyssavirus-Diagnose in unserem Labor ist in Abbildung 1dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Laborstandard-Betriebsverfahren (SOP) bietet ein serielles Verfahren zur Prüfung von Fledermausproben auf das Vorhandensein von Lyssavirus-Antigenen in Taiwan. Zu den wichtigsten Schritten gehört der Einsatz von FAT und RT-PCR. Die Auswahl geeigneter Proben und die erfolgreiche Isolierung des Virus sind ebenfalls wichtig. Darüber hinaus wurde einige Fehlerbehebung während der Überwachung von Fledermaus Lyssaviren durchgeführt. Der Hauptunterschied waren die Zieltiere. Ursprünglich (2008-2009) waren die Ziel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai und Ya-Lan Li für ihre Unterstützung während dieser Studie. Diese Studie wurde durch das Stipendium Nr. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) des Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture, Executive Yuan, Taiwan, unterstützt.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trppsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trppsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
Riferimenti
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