נוהל הפעלה רגיל של מעקב וירוס של אוכלוסיית העטלף בטייוואן
Summary
פרוטוקול זה מציג נוהל הפעלה מעבדה סטנדרטית עבור בדיקות אבחון של אנטיגנים lyssavirus ירוס בעטלפים בטייוואן.
Abstract
וירוסים בתוך הסוג lyssavirus הם zoonotic פתוגנים, ולפחות שבעה מינים lyssavirus קשורים למקרים אנושיים. בגלל עטלפים הם מאגרי הטבע של רוב lyssaviruses, תוכנית מעקב lyssaviruses של עטלפים נערך בטייוואן מאז 2008 כדי להבין את האקולוגיה של וירוסים אלה עטלפים. בתוכנית זו, ארגונים לא ממשלתיים לשימור ומרכזים מקומיים לבקרת מחלות בעלי חיים שיתפו פעולה לאיסוף עטלפים מתים או עטלפים המתים מחולשה או ממחלות. רקמות המוח של עטלפים הושגו באמצעות נקרופסי ונתון לבדיקה אנטי פלואורסצנט פלורסנט ישירה (FAT) והפוכה תמלול שרשרת פולימראז (RT-PCR) לאיתור של אנטיגנים lyssavirus וחומצות גרעין. עבור ה-FAT, מומלץ לפחות שתי שערי מעלה של אבחון כלבת. עבור ה-RT-PCR, שני סטים של התחל (JW12/N165-146, N113F/N304R) משמשים כדי להגביר רצף חלקי של הגן הנואופפרוטאין ליקיה. תוכנית ההשגחה הזאת עוקבת אחר. וירוסים וסוכני zoonotic אחרים בעטלפים טייוואן בת lyssavirus נמצא בשני מקרים של pipistrelllllllllllllllllllllllllllllllllllla ממצאים אלה צריכים ליידע את הציבור, אנשי הבריאות, ומדענים של הסיכונים הפוטנציאליים של יצירת קשר עם עטלפים וחיות בר אחרות.
Introduction
וירוסים בתוך הסוג Lyssavirus הם zoonotic פתוגנים. יש לפחות שבעה מינים ליסביסםקשורים למקרים אנושיים1. בנוסף 16 מינים בסוג זה1,2,3, טייוואן בת lyssavirus (twblv)4 ו kotalahti בת lyssavirus ירוס5 זוהו לאחרונה עטלפים, אבל המצבים הטקמיים שלהם עדיין לא להיקבע.
עטלפים הם המארחים הטבעיים של מרבית lyssaviruses, למעט מוקדי lyssaviruses וירוס ikoma, אשר עדיין לא זוהו בכל עטלפים1,2,3,6. המידע על lyssaviruses בעטלפים אסיאתי עדיין מוגבל. שניים מהווירוסים הבלתי מאופיינים בעטלפים אסיאתיים (אחד בהודו והאחר בתאילנד)7,שמונה דווחו. אחד מהמקרים האנושיים הקשורים לנשיכת עטלף בסין דווח ב-2002, אבל האבחנה נעשתה רק על ידי התבוננות קלינית9. במרכז אסיה, וירוס lyssavirus נגיף זוהה בתוך העכבר הקטן אוזן אוזניים (Myotis בליית) בקירגיסטאן ב 1991, ו-וירוס ליסרו היתה מזוהה בעטלף השפם (myotis myסטרינוס) בטג’יקיסטן ב 200110. בדרום אסיה, העטלף ליסביססביט היה מזוהה ב שועל ההודי המעופף (פטרפוס medius) בסרי לנקה ב 20153. בדרום מזרח אסיה, מספר מחקרים סרולוגיים על עטלפים בפיליפינים, תאילנד, בנגלדש, קמבודיה, ו וייטנאם הראו משתנה seropreערכיות11,12,13,14, . חמש עשרה למרות Irkut lyssavirus זוהה במחבט גדול יותר-חוטם (Murina leucogaster) במחוז ג ‘ ילין, סין ב 201216, המינים המדויקים מיקומים של lyssavirus באוכלוסיית העטלף מזרח אסיה נותרו לא ידועים.
כדי להעריך את הנוכחות של lyssavirus באוכלוסיות בת הטייוואנית, תוכנית מעקב העסקת הן שומן ישיר RT-PCR הופעלה. טייוואן בת lyssavirus זוהה בשני מקרים של pipistrelle יפני (Pipistrellus)4 ב 2016 – 2017. במאמר הנוכחי, הליך מעבדה בתקן הפעלה מוצג עבור lyssavirus ירוס מעקב של אוכלוסיית העטלף בטייוואן. תרשים הזרימה של אבחון ליסביזוירוס במעבדה שלנו מוצג באיור 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
הליך זה תקן מעבדה הפעלה (SOP) מספק תהליך טורי לבדיקת דגימות עטלף לנוכחות של אנטיגנים lyssavirus בטייוואן. השלבים העיקריים כוללים את התעסוקה של FAT ו RT-PCR. הבחירה של דגימות מתאימות ובידוד מוצלח של הנגיף הם גם חשובים. בנוסף, פתרון בעיות מסוימות נערך במהלך הניטור של lyssaviruses העטלף. ההבדל העיקרי היה בעלי ה…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לטיין-צ’נג לי, יי טאנג לין, צ’יה-ג’ונג טסאי, ו-Ya-Lan Li על עזרתם במהלך המחקר. מחקר זה היה נתמך על ידי גרנט no 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) מן הלשכה של בעלי חיים ובריאות הצמח בידוד, מועצת החקלאות, ההנהלה יואן, טייוואן.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trppsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trppsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
Riferimenti
- Kuzmin, I. V., Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. Basic facts about lyssavirus. Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. , 3-21 (2014).
- Aréchiga Ceballos, N., et al. Novel lyssavirus in bat, Spain. Emerging Infectious Diseases. 19 (5), 793-795 (2013).
- Gunawardena, P. S., et al. Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka. Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat. Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).
- Pal, S. R., et al. Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India. Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).
- Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand. Nature. 216 (5113), 384 (1967).
- Tang, X. Pivotal role of dogs in rabies transmission, China. Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences. Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).
- Arguin, P. M., et al. Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines. Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).
- Lumlertdacha, B., et al. Survey for bat lyssaviruses, Thailand. Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al. Lyssavirus surveillance in bats, Bangladesh. Emerging Infectious Diseases. 12 (3), 486-488 (2006).
- Reynes, J. -. M., et al. Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia. Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).
- Nguyen, A. T., et al. Bat lyssaviruses, northern Vietnam. Emerging Infectious Diseases. 20 (1), 161-163 (2014).
- Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097 (2013).
- Kaplan, M. M., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. Safety precautions in handling rabies virus. Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed. , 3-8 (1996).
- Smith, I., Wang, L. F. Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans. Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).
- Corbet, G. B., Hill, J. E. . The mammals of the Indomalayan region: a systematic review. , (1992).
- Mayer, F., von Helversen, O. Cryptic diversity in European bats. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 268 (1478), 1825-1832 (2001).
- Epstein, J. H., Field, H. E., Wang, L. F., Cowled, C. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases. , 249-280 (2016).
- . Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019)
- Hayman, D. T. S., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
- Franka, R., et al. A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus). Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).
- Trimarchi, C. V., Smith, J. S., Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. Diagnostic evaluation. Rabies, 1st ed. , 307-349 (2002).
- Moldal, T., et al. First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway. BMC Veterinary Research. 13, 216 (2017).
- Robardet, E., et al. Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates. Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).
- Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A., Jackson, A. C. Laboratory diagnosis of rabies. Rabies, 3rd ed. , 409-459 (2013).
- Fischer, M., et al. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses–results of a ring trial among European laboratories. PLoS ONE. 8 (3), 58372 (2013).
- David, D., et al. Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains. Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).
- Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques. Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).
