Procedimiento Operativo Estándar para la Vigilancia de Lyssavirus de la Población Bat en Taiwán
Summary
Este protocolo introduce un procedimiento operativo de laboratorio estándar para las pruebas de diagnóstico de antígenos de lissavirus en murciélagos en Taiwán.
Abstract
Los virus del género Lyssavirus son patógenos zoonóticos, y al menos siete especies de lissavirus están asociadas con casos humanos. Debido a que los murciélagos son reservorios naturales de la mayoría de los lissavirus, se ha llevado a cabo en Taiwán un programa de vigilancia de los murciélagos de lissavirus para comprender la ecología de estos virus en los murciélagos. En este programa, organizaciones no gubernamentales de conservación de murciélagos y centros locales de control de enfermedades animales cooperaron para recoger murciélagos muertos o murciélagos que morían de debilidad o enfermedad. Los tejidos cerebrales de los murciélagos se obtuvieron a través de la necropsia y se sometieron a una prueba directa de anticuerpos fluorescentes (FAT) y a una reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) para la detección de antígenos de lissavirus y ácidos nucleicos. Para el FAT, se recomiendan al menos dos conjugados diferentes de diagnóstico de rabia. Para el RT-PCR, se utilizan dos conjuntos de imprimaciones (JW12/N165-146, N113F/N304R) para amplificar una secuencia parcial del gen del núcleo de glioproteína. Este programa de vigilancia monitorea los lissavirus y otros agentes zoonóticos en murciélagos. El lyssavirus del murciélago de Taiwán se encuentra en dos casos de la pipistrelle japonesa (Pipistrellus abramus) en 2016-2017. Estos hallazgos deben informar al público, a los profesionales de la salud y a los científicos de los riesgos potenciales de contactar murciélagos y otras especies silvestres.
Introduction
Los virus del género Lyssavirus son patógenos zoonóticos. Hay al menos siete especies de lissavirus asociadas con casos humanos1. Además de las 16especies de este género 1,2,3, Taiwan bat lyssavirus (TWBLV)4 y Kotalahti bat lyssavirus5 han sido identificados recientemente en murciélagos, pero sus estados taxonómicos aún no han sido identificados en murciélagos, pero sus estados taxonómicos aún no han sido identificados en murciélagos, pero sus estados taxonómicos aún no han determinarse.
Los murciélagos son los huéspedes naturales de la mayoría de los lyssavirus, con la excepción de Mokola lyssavirus e Ikoma lyssavirus, que aún no han sido identificados en ningún murciélago1,2,3,6. La información sobre los lissavirus en los murciélagos asiáticos sigue siendo limitada. Se han notificado dos lissavirus no caracterizados en murciélagos asiáticos (uno en la India y el otro en Tailandia)7,8. Un caso de rabia humana asociado con una mordedura de murciélago en China se notificó en 2002, pero el diagnóstico se hizo sólo por observación clínica9. En Asia Central, Aravan lyssavirus fue identificado en el murciélago de orejas de ratón menor (Myotis blythi) en Kirguistán en 1991, y Khujand lyssavirus fue identificado en el murciélago bigote (Myotis mystacinus) en Tayikistán en 200110. En el sur de Asia, Gannoruwa murciélago lyssavirus fue identificado en el zorro volador indio (Pteropus medius) en Sri Lanka en 20153. En el Sudeste Asiático, varios estudios serológicos sobre murciélagos en Filipinas, Tailandia, Bangladesh, Camboya y Vietnam mostraron seroprevalencia variable11,12,13,14, 15. Aunque El irkut lyssavirus se identificó en el murciélago de nariz de tubo mayor (Murina leucogaster) en la provincia de Jilin, China en 201216, las especies exactas y lugares de lissavirus en las poblaciones de murciélagos de Asia oriental siguen siendo desconocidos.
Para evaluar la presencia de lissavirus en las poblaciones de murciélagos taiwaneses, se inició un programa de vigilancia que empleaba tanto FAT directo como RT-PCR. El lyssavirus del murciélago de Taiwán fue identificado en dos casos de la pipistrelle japonesa (Pipistrellus abramus)4 en 2016-2017. En el presente artículo, se introduce un procedimiento operativo estándar de laboratorio para la vigilancia del lissavirus de la población de murciélagos en Taiwán. El diagrama de flujo del diagnóstico de lissavirus murciélago en nuestro laboratorio se presenta en la Figura1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este procedimiento operativo estándar de laboratorio (SOP) proporciona un proceso en serie para probar muestras de murciélagos para detectar la presencia de antígenos de lissavirus en Taiwán. Los pasos clave incluyen el empleo de FAT y RT-PCR. La selección de muestras adecuadas y el aislamiento exitoso del virus también son importantes. Además, se llevó a cabo algunos problemas de resolución durante el monitoreo de los lyssavirus de murciélagos. La principal diferencia fueron los animales objetivo. Inicialmente…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai y Ya-Lan Li por su ayuda durante este estudio. Este estudio fue apoyado por la concesión No. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) de la Oficina de Inspección y Cuarentena de Sanidad Animal y Vegetal, Consejo de Agricultura, Yuan Ejecutivo, Taiwán.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trppsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trppsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
Riferimenti
- Kuzmin, I. V., Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. Basic facts about lyssavirus. Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. , 3-21 (2014).
- Aréchiga Ceballos, N., et al. Novel lyssavirus in bat, Spain. Emerging Infectious Diseases. 19 (5), 793-795 (2013).
- Gunawardena, P. S., et al. Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka. Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat. Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).
- Pal, S. R., et al. Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India. Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).
- Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand. Nature. 216 (5113), 384 (1967).
- Tang, X. Pivotal role of dogs in rabies transmission, China. Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences. Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).
- Arguin, P. M., et al. Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines. Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).
- Lumlertdacha, B., et al. Survey for bat lyssaviruses, Thailand. Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al. Lyssavirus surveillance in bats, Bangladesh. Emerging Infectious Diseases. 12 (3), 486-488 (2006).
- Reynes, J. -. M., et al. Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia. Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).
- Nguyen, A. T., et al. Bat lyssaviruses, northern Vietnam. Emerging Infectious Diseases. 20 (1), 161-163 (2014).
- Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097 (2013).
- Kaplan, M. M., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. Safety precautions in handling rabies virus. Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed. , 3-8 (1996).
- Smith, I., Wang, L. F. Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans. Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).
- Corbet, G. B., Hill, J. E. . The mammals of the Indomalayan region: a systematic review. , (1992).
- Mayer, F., von Helversen, O. Cryptic diversity in European bats. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 268 (1478), 1825-1832 (2001).
- Epstein, J. H., Field, H. E., Wang, L. F., Cowled, C. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases. , 249-280 (2016).
- . Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019)
- Hayman, D. T. S., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
- Franka, R., et al. A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus). Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).
- Trimarchi, C. V., Smith, J. S., Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. Diagnostic evaluation. Rabies, 1st ed. , 307-349 (2002).
- Moldal, T., et al. First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway. BMC Veterinary Research. 13, 216 (2017).
- Robardet, E., et al. Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates. Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).
- Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A., Jackson, A. C. Laboratory diagnosis of rabies. Rabies, 3rd ed. , 409-459 (2013).
- Fischer, M., et al. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses–results of a ring trial among European laboratories. PLoS ONE. 8 (3), 58372 (2013).
- David, D., et al. Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains. Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).
- Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques. Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).
