Summary
Denna artikel beskriver deuteriumoxid utspädningsteknik i två däggdjur, en insektsätare och köttätare, för att bestämma totalt kroppsvatten, muskelmassa, kroppsfett massa, och vattenförbrukning.
Abstract
Body condition scoring system och kroppsförhållanden index är vanliga tekniker som används för att bedöma hälsotillstånd eller lämplighet av en art. Kroppstillstånd poängsättning system är utvärderare beroende och har potential att vara mycket subjektiva. Kroppstillståndindex kan blandas ihop genom födosök, effekterna av kroppsvikt, samt statistiska och inferential problem. Ett alternativ till kroppens tillstånd poängsystem och kroppens tillstånd index använder en stabil isotop såsom deuteriumoxid för att bestämma kroppssammansättning. Deuteriumoxidutspädningsmetoden är en repeterbar, kvantitativ teknik som används för att uppskatta kroppssammansättning hos människor, vilda djur och tama arter. Dessutom kan deuteriumoxidutspädningstekniken användas för att bestämma vattenförbrukningen hos ett enskilt djur. Här beskriver vi anpassningen av deuteriumoxid utspädningsteknik för att bedöma kroppssammansättning i stora bruna fladdermöss(Eptesicus fuscus)och för att bedöma vattenförbrukning hos katter (Felis catis).
Introduction
Body condition scoring system och kroppsförhållanden index är vanliga tekniker som används för att bedöma hälsostatus eller lämplighet av en art1,2. Många inhemska och zoologiska arter har unika kropp tillstånd scoring (BCS) system som används för att bedöma ett djurs muskler och ytlig fettvävnad3. BCS-bedömningen bygger dock på utvärderaren, vilket innebär att BCS är en objektiv eller halvkvantitativ mätning vid bedömningen av en utbildad utvärderare. I djurarter, kroppsförhållanden index används ofta snarare än BCS och är baserade på ett förhållande av kroppsmassa till kroppsstorlek eller kroppsmassa till underarm2. Kroppstillstånd indicis är ofta förvirrade av effekterna av födosök och kan blandas av kroppsstorlek samt statistiska och inferential problem4.
Ett alternativ till kroppens tillstånd poängsystem och kroppens tillstånd index använder en stabil isotop för att bestämma kroppssammansättning. En vanlig stabil isotop är deuteriumoxid (D2O), en icke-radioaktiv form av vatten där väteatomer är deuteriumisotoper. Den deuteriumoxid utspädningmetod som beskrivs i denna studie kan vara en icke-subjektiv, kvantitativ och repeterbar teknik som används för att uppskatta kroppssammansättning hos människor5 och ett brett spektrum av arter4,6,7. Denna teknik kan vara fördelaktigt för att studera kroppens sammansättning i vilda djur. Den kan till exempel användas för att bedöma längsgående förändringar i kroppssammansättningen, till exempel före och efter en hanteringsåtgärd. Men i vissa vilda arter deuteriumoxid kan överskatta den faktiskavattenhalten 8. När tekniken anpassas för en art är det därför viktigt att validera metoden genom att jämföra deuteriumoxidmetoden med slaktkroppens analys för icke-utrotningshotade arter. För hotade och utrotningshotade arter bör en icke-förstörande metod som dubbel röntgenabsorptiometri (DXA) betraktas som en alternativ jämförelsemetod med den guldstandarddestruktiva metoden för fullständig slaktkroppanalys.
Förutom kroppssammansättning kan D2O-utspädningstekniken användas för att bestämma vattenförbrukningen för ett enskilt djur9. Denna unika tillämpning av D2O kan användas för att svara inte bara på forskningsfrågor, utan kan vara användbar för att bedöma vattenförbrukningen för enskilda djur som är inrymt i stora sociala miljöer.
Här beskriver vi anpassningen av D2O-utspädningstekniken för bedömning av kroppssammansättning i en insektsätare, stora bruna fladdermöss(Eptesicus fuscus), och för att bedöma vattenförbrukningen i en köttätare, katter (Felis catis).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment som beskrivs här godkändes av University of Missouri Animal Care and Use Committee och genomfördes under Missouri Department of Conservation (MDC) Wildlife Scientific Collection tillstånd (Tillstånd #16409 och #17649).
1. Beredning av steril, isotonisk, salinerat D2O lagerlösning
- Gör en 50 ml lagerlösning på 9,0 g/L salinerade D2O.
- Väg 450 mg läkemedelskvalitet NaCl och överför alla NaCl till en 100 ml, steriliserad bägare. Registrera den exakta mängden NaCl till 4 decimaler i laboratorieanteckningsboken.
- Använd en steril graderad cylinder, mät 50 g ≥ 99,8 % deuteriumoxid och överför till den sterila bägaren som innehåller NaCl. Registrera den exakta mängden deuteriumoxid till 4 decimaler i laboratoriets anteckningsbok eller kalkylblad.
- Filter 10 ml isosmotisk styrka NaCl (9,0 g/L) genom ett icke-pyrogensterilt diskfilter med submicron porer (0,2 μm).
- Fäst en 20 G nål på det icke-pyrogena sterila diskfiltret med submicron porer (0,2 μm) försedda med en 10 ml sprutatunna. För in i septum av en 100 ml steril tom injektionsflaskor.
- Fäst ett vakuumrör på en 22 G nål och sätt in nålen i septum av 100 ml steril tom injektionsflaskan.
- Häll 10 ml av lagerlösningen i sprutan. Slå långsamt på vakuumet tills D2O-lagerlösningen börjar långsamt filtrera in i den sterila injektionsflaskan. Fortsätt att hälla D2O lagerlösning i sprutan fat tills alla 50 ml filtreras.
OBS: Lagerlösningen kan behöva spädas eller koncentreras beroende på vilken dos som krävs. Dosen D2O varierar beroende på arten och känsligheten hos analysmetoden. För katter användes arbetslösningen för att administrera en dos på 0,7 g/kg D2O. Den lagerlösning som beskrivs ovan minimerar mängden NaCl-lösning som introduceras subkutant till djuret samtidigt som den möjliggör korrekt mätning av dosen. För små däggdjur som fladdermöss måste denna koncentration spädas ut till en arbetslösning som 0,1600 g/ml. Denna koncentration gör att dosen 0,75 g/kg D2O kan mätas och administreras noggrant i cirka 100 μL eller mindre NaCl-lösning.
2. Beredning av sterila, isototoniska, salinerade D2O lager arbetslösning för fladdermöss
- Väg en tom steril injektionsflaskan på 10 ml och registrera vikt till närmaste 4 decimaler. Tare skala.
- Använd en 1,0 ml spruta för att överföra 0,65 ml av D2O-lagerlösningen till den tared, 10 ml tomma sterilinjektionsflaskan. Rekordvikt på D2O till 4 decimaler. Tare skala.
- Beräkna volymen d2O i den tomma injektionsflaskan på 10 ml. Använd följande ekvation.
där W registreras vikt och D är densiteten 99,8% D2O (1,107 g/ml). - Använd den beräknade volymen och den kända vikten av D2O för att bestämma volymen isotonisk saline som krävs för att göra ~0,1600 g/ml-arbetslösning.
- För in i septum av den sterila injektionsflaskan på 10 ml, 22 G-nålen (fäst vid vakuumröret). För in i septum av den sterila injektionsflaskan på 10 ml, 20 G-nålen (fäst vid ett 0,22 μm sprutfilter som är utrustat med en 10 ml sprutatunna).
- Häll den beräknade massan/volymen isotonisk NaCl i sprutan sprutpipan och slå på vakuumet så att ett långsamt dropp i den sterila 10 ml-flaskan.
- Registrera vikten på injektionsflaskan och se till att en ~0,1600 g/ml-arbetslösning skapas.
3. Bestämning av kroppssammansättning av stora bruna fladdermöss(Eptesicus fucsus)med D2O
OBS: Lagerlösningen för D2O som används i protokollet är 0,1598 g/ml. Innan du samlar blod, se till att avlägsnande av upp till 200 μl blod kommer att vara ≤ 10% av den totala blodvolymen av fladdermusen och är inom den institutionella djurvård s (IACUC) etablerade riktlinjer för blodinsamling. Alla djur bör fastas eller buken palpated för att säkerställa en tom mage. En nyligen måltid kan förändra djurets vikt som resulterar i förvirrade resultat eftersom beräkningar för att bestämma kroppsfett är beroende av djurets kroppsmassa.
- Söva en stor brun fladdermus.
- Använd 5,0% isofluran för induktion. Håll ett stabilt plan av anestesi med 0,5%−3,0% isofluran.
- Bestäm rätt anestesidjup genom att testa pedalens uttagsreflex (nypa fladdermusens tår). Fladdermusen bör inte svara på känslan och andningsfrekvensen bör förbli långsam och stabil. Justera isofluran efter behov för att upprätthålla ett stabilt plan av anestesi.
- Registrera isofluran nivå, hjärtfrekvens, andningsfrekvens och annan information som krävs av IACUC.
- Väg den stora bruna fladdermusen och registrera vikten till 4 decimaler.
- Rengör uropatagium (svansmembran) över interfemoralven med en alkohol prep pad och låt torka. Applicera ett tunt lager vaselin över interfemoralvenen.
- Använd en 29 G nål för att punktera den dorsala delen av interfemoralven och samla 100 μl blod med hjälp av plast natriumheparin kapillärrör. Säkerställa tillräcklig blandning av hela blodet med natriumheparin genom att försiktigt rulla varje rör efter insamling och märka röret.
- Med hjälp av en DXA-maskin kalibrerad för små däggdjur, få tre DXA skanningar av bat10.
- Bestäm massan (i g) av D2O för att injicera genom att multiplicera fladdermusvikten i kg med D2O-dosen 0,75 g/kg. Bestäm volymen av den beräknade D2O-dosen (V) genom att dividera vikten på D2O-dosen genom koncentrationen av arbetslösningen.
- Använd en insulinspruta med en 29 G nål fäst för att dra upp volymen av D2O beräknas. Väg D2O, insulinsprutan och nålen. Registrera till 4 decimaler.
- Injicera D2O subkutant över den dorsala höftregionen i den sövda fladdermusen.
- Låt fladdermusen återhämta sig från anestesi och registrera injektionstiden.
- Omedelbart efter injektionen, väg den nu tomma insulinsprutan med 29 G nålen fastsatt. Registrera vikten till 4 decimaler.
- Bestäm dosen D2O som injiceras genom att insulinsprutans efterinjektionsvikt subtraheras från insulinsprutan för injektion från insulinsprutan förinjektion. Registrera till 4 decimaler.
- Inom 30 min post blodinsamling, använd en hematokrit centrifug för att snurra varje kapillärrör i 5 min. Om hematokritcentrifugen tillåter flera hastigheter, ställ in på 10 000 x g.
- Använd en skarp sax för att skära plastkapillärröret mellan hela blodet och plasma. Använd ett 200 μL pipett för att driva ut plasman direkt i ett märkt, 500 μL-lagringsrör.
- Efter jämviktsperioden, samla ytterligare 100 μL blod från interfemoralven.
OBS: Jämviktsperioden varierar beroende på art och om fladdermössen går in i torpor. För stora bruna fladdermöss är typiskt 2 h tillräckligt för jämviktsperioden. - Separat plasma i ett andra märkt, 500 μL mikrocentrifugskruvtopprör genom att upprepa steg 3.13. Förvara prover vid -20 °C eller kallare tills analys.
4. Fourier-transform infraröd spektrophotometri analys
- Ställ in temperaturen på ett sandbad till 60 °C för att underlätta destillation (tillåt separation av vatten och D2O från andra blodkomponenter).
- Pipett 50 μl av varje plasmaprov och standard på insidan av ett koniskt mikrocentrifugrörlock på 1,5 ml. Inklusive standarder som innehåller kända koncentrationer av D2O som kvalitetskontroll.
OBS: Helst varje djur kommer att ha tre replikat per prov och genomsnittet av de tre replikerade rapporteras. På grund av den begränsade provvolymen och den mängd prov som krävs för FT-IR-utrustning som används av författarna utfördes inga replikat för fladdermusproverna. Om något prov innehåller mindre än 50 μl plasma, pipettprovet belopp på koniska mikrocentrifugrör locket och registrera volymen. - Håll mikrocentrifuglocket upp och ner och skruva fast 1,5 ml koniska mikrocentrifugröret på locket. Placera det inverterade (upp och nedfällda) röret med locket i kontakt med sanden i sandbadet i minst 12 timmar (över natten).
- Efter 12 h, ta bort locket och byt ut mot ett nytt, rent lock. Puls mikrocentrifugröret i 10 s i en centrifug.
- Skapa följande standarder: 0 ppm (0 mg D2O i 1 L destillerat vatten), 293 ppm (293 mg D2O i 1 L destillerat vatten), 585 ppm (585 mg D2O i 1 L destillerat vatten), 878 ppm (878 mg D2O i 1 L destillerat vatten) och 1170 ppm D2O (1170 mg D2O i 1 L destillerat vatten).
Värdena ovan föreslås för en standardkurva. Alternativa värden som 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, och så vidare kan användas. - Installera en flytande transmissionscell i fourier-transform infraröd spektrofotometri (FTIR) spektrometer(Table of Materials). Fyll cellen med metanol och anslut injektionsporten. Fyll långsamt cellen med bakgrundsvatten samtidigt försiktigt ta bort metanolsprutan för att minska risken för luftbubblor. Fäst slangen i utdataporten så att proverna tas bort efter analysen.
- Förbered FTIR-spektrometerprogramvaran(Table of Materials)för analys av D2O i vatten. Parameterinställningarna för spektrometerprogramvaran som används i det här protokollet visas i tabell 1.
- Samla in ett bakgrundsprov med spädningsfiltret, 0,22 μmfiltrerat, destillerat vatten. Detta bör vara samma vatten som används för normerna.
- Injicera 40 μL av 0 ppm D2O och registrera spektra. Spara spektra som en CSV-fil (comma separated values).
- Fortsätt att injicera och spara spektra av alla standarder för att skapa en standardkurva.
- Upprepa bakgrunds- och standardkurvan var 60−90 min.
- Injicera 40 μl av varje destillerat prov i vätsketransmissionscellen och spara spektrat.
OBS: Ändra insprutningsvolymen för standarderna och destillerade prover baserat på volymen av flytande transmissionscell. Använd en flytande transmissionscell med mindre volym om provvolymen är under 40 μL eller späd 1:1 med bakgrundsdestillerat vatten. - Bestäm koncentrationen av D2O av varje prov från FTIR-spektra med hjälp av ett kalkylprogram enligt Jennings et al.11 eller spektralmjukvaran. När replikat utförs använder du den genomsnittliga koncentrationen för att beräkna kroppssammansättningen.
5. Beräkning av kroppssammansättning
- Konvertera deuteriumanrikment (ppm) till atomer procent koncentration för varje prov med följande ekvation12:
där x är provets uppmätta ututeriumberikning (ppm) och 0,0001557 är den molfraktion av deuterium som rapporterats i Wienstandard medelvatten (VSMOW)13. - Beräkna totalt kroppsvatten för varje prov med följande ekvation4,12,14:
)
där E är den uppmätta anrikningen (atom%) av deuterium i provet efter bakgrundskorrigering, B är injektionsmassan i g, och 0,998 är koncentrationen av injicerad D2O.
OBS: Deuterium utbyte med labilväte orsakar en 2% överskattning av den totala kroppsvattenmassan. Totalt kroppsvatten bör korrigeras genom att minska den totala uppskattningen av kroppsvattenmassan med 2% av kroppsvikten. - Uppskatta den fettfria massan (muskelmassa och alla andra icke-fetthalta komponenter) i varje fladdermus med hjälp av följande ekvation:
OBS: Använd det konventionellt accepterade värdet på 0,732 för fraktionerad fukthalt i muskelmassa för friska, euhydrerade, icke-ammande fladdermöss. Den fraktionerade fukthalten i fettfri massa kan förändras i ammande stora bruna baserat på post-partum vecka15. För andra arter, använd de värden som publiceras i litteraturen eller bestämma fraktionerad fukthalt i muskelmassa innan du utför beräkningar av muskelmassan. - Uppskatta kroppsfettmassan med följande ekvation:
- Konvertera kroppsfettmassan i g till procent kroppsfett massa med hjälp av följande ekvation:
)
6. Bestämning av vattensammansättning i en köttätare(Felis catus,tamkatt)
- Förbered lagerlösningen enligt beskrivningen i avsnitt 1.
- Väg varje katt till närmaste 3 decimaler och registrera vikt. Beräkna dosen för varje katt enligt beskrivningen i steg 3.6 med en D2O-dos på 0,70 g/kg.
- Förbered varje dos enligt beskrivningen i steg 3.7−3.8. med en 3 ml eller 5 ml spruta med en 22 G nål i stället för en insulinspruta.
- Samla in 500 μl helblod och därefter administrera subkutant de 0,7 g/kg D2O. Centrifugera helblod vid 2 000 x g i 15 min och förvara plasma i 1,5 ml mikrocentrifugskruvtopprör vid -20°C till sen analysen.
- Samla in 500 μl helblod 4 h efter injektionen. Centrifughelblod vid 2 000 x g i 15 min och förvara plasma i 1,5 ml mikrocentrifugskruvtopprör vid -20 °C tills analysen.
- Samla in 500 μl helblod 14 dagar efter injektionen. Centrifughelblod vid 2 000 x g i 15 min och förvara plasma i 1,5 ml mikrocentrifugskruvtopprör vid -20 °C tills analysen.
OBS: Antalet dagar mellan blodinsamling kan baseras på de experimentella behoven och perioden efter injektionen då D2O kan upptäckas över bakgrundsnivåerna. Fjorton dagar var längden på kosten behandlingsblock från Hooper et al.9. - Utför FT-IR-analys enligt avsnitt 4 och beräkna kroppssammansättningen enligt avsnitt 5 i detta protokoll.
- Beräkna vattenförbrukningen i mL/dag med hjälp av följande ekvationer:
Där TBW är totalt kroppsvatten, initialA D2O och slutlig D2O är de koncentrationer som mäts i ppm i postinjektionen D2O-prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deuteriumoxidutspädningstekniken kan användas för att bedöma kroppssammansättningen hos en mängd olika arter. För att visa anpassningsförmågan rapporterar vi den första användningen av deuteriumoxidutspädningstekniken i en nordamerikansk insektsätande fladdermusart, Eptesicus fuscus, den stora bruna fladdermusen för representativa resultat. En tidsplatå slutfördes genom att ta före och efter D2O injektion blodprov som bör göras med alla arter där jämviktsperioden är okänd. Det fastställdes att två timmar efter injektion en icke-torpid fladdermöss var tillräcklig för jämvikt. Med jämviktstiden känd, den totala kroppsvatten, mager kroppsmassa, och kroppsfett massa för 13 vildfångade stora bruna fladdermöss och 8 fångenskap stora bruna fladdermöss fastställdes(Tabell 2). Ytterligare 2 vildfångade stora bruna fladdermöss och 5 fångenskap stora bruna fladdermöss var fast beslutna att ha en negativ kroppsfett massa. En negativ kroppsfettmassa beräknas på grund av en eller flera av följande skäl: att inte få hela dosen av deuteriumoxid, blir torpid under jämviktsfasen, med onormalt stora fettmassor och minimal muskelmassa, eller fladdermöss med under 3%−5% kroppsfett som bestäms av DXA (tabell 3).
White-nose syndrom har orsakat många fladdermus arter att minska, så tekniken jämfördes med kroppsfett mätt med DXA. Figur 1 visar den procentandel av kroppsfett som bestäms av D2O-utspädningstekniken och DXA (n = 19). De två teknikerna var väl korrelerade med en Pearsons r = 0,897 (figur 2) och var inte statistiskt olika (enkelriktad analys av varians (ANOVA), F-värde = 0,366, p = 0,549). Kroppsfettet visade starka korrelationer mellan kroppsfett och kroppsvikt (figur 3). D2O-utspädningstekniken övergick inte konsekvent eller underskattade kroppsfettmassan.
Deuteriumoxidmetoden har tidigare validerats hos katter16. Tabell 4 visar ett exempel på det totala kroppsvattnet, muskelmassa och kroppsfettmassa av en enda katt9. Hooper et al.9 var den första att rapportera användningen av deuteriumoxid utspädning för att mäta vattenförbrukningen av socialt inrymt djur med den dagliga vattenförbrukningen av katterna under varje kostblock av experimentet, som visas i figur 4.
Figur 1: Deuteriumoxid och DXA-linjetomt. Varje punkt representerar kroppsfett procent av en enskild fladdermus som bestäms av DXA eller deuteriumoxid. Medelvärdet är den ljusgröna punkten med felfält som anger standardfelet i medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Procentandel av kroppsfett i stora bruna fladdermöss. Deming regression (fast blå linje, Pearsons r = 0,897) jämföra andelen kroppsfett bestäms av DXA (x-axel, referensmetoden) och andelen kroppsfett bestäms av deuteriumoxid (y-axeln, testmetoden) i stora bruna fladdermöss med 95% konfidensintervall betecknas med grå skuggning. Den gröna streckidentitetslinje som dras representerar regressionsraden när metoderna är lika. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Procentandel av kroppsfett i stora bruna fladdermöss jämfört med kroppsvikt. Kroppsvikt en fladdermus som ritas mot kroppsfettprocenten bestäms av D2O eller DXA. Ett starkt samband finns mellan kroppsvikten och kroppsfettet som bestäms av DXA (mörkblå linje, Pearsons r = 0,88) och D2O (blå linje, Pearsons r = 0,86). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Vattenförbrukning av socialt inrymt katter. Representativa resultat av den dagliga vattenförbrukningen av socialt inrymt katter under ett experiment som utvärderar effekterna av kostväljare på vattenförbrukningen. Denna siffra har ändrats från Hooper et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Parametern | Inställningen |
| Antal skanningar | 64 |
| Upplösning | 2 |
| Dataavstånd | 0,946 cm-1 |
| Slutligt format | Absorbansen |
| Korrigering | Ingen |
| Använda fasta Y-axelgränser i insamlingsfönstret | Min -0,01, Max 0,03 |
| Bänkområde | Max 6,38, Min -5,02, Loc 1024 |
| Total absorberande toppkänslighet | 50 |
| fransar eller kanalkänslighet | 80 |
| Derivattoppar sensativitet | 51 |
| Felkänslighet för baslinjen | 50 |
| CO2 nivåer känslighet | 19 |
| H2O nivåer känslighet | 19 |
| Apodiseringsläge | Happ-Genzel |
| Faskorrigering | Mertz |
| Filteruppsättning baserat på | Hastighet |
| lågpassfilter | 11,000 |
| högpassfilter | 20 |
Tabell 1: Spektrala programvaruinställningar. Parameterinställningar som används för spektralinspelningsprogram.
| Djur | Arter | Kroppsvikt (kg) |
D2Injiceras g) |
Totalt kroppsvatten g) |
Muskelmassa g) |
Kroppsfett massa g) |
Kroppsfett massa (%) |
DXA mager + bmc g) |
DXA fett g) |
DXA fett (%) |
| 1 | Eptesicus fuscus | 0.01715 | 0.0740 | 11.80 | 16.15 | 1.00 | 5.80 | 14.65 | 0.75 | 4.80 |
| 2 | Eptesicus fuscus | 0.01950 | 0.0920 | 13.80 | 18.83 | 0.69 | 3.50 | 16.20 | 1.40 | 7.90 |
| 3 | Eptesicus fuscus | 0.01677 | 0.08 | 11.33 | 15.47 | 1.30 | 7.74 | 11.33 | 1.30 | 7.74 |
| 4 | Eptesicus fuscus | 0.02129 | 0.097 | 12.51 | 17.09 | 4.20 | 19.7 | 15.9 | 19.65 | 19.2 |
Tabell 2: Kroppssammansättning av stora bruna fladdermöss. De representativa resultaten av total kroppsvatten, muskelmassa och kroppsfett som bestäms av deuteriumoxid utspädning i stora bruna fladdermöss visas i kolumnerna 5−8. Representativa resultat av muskelmassa n plus benmineralhalt och kroppsfett som bestäms av DXA i samma stora bruna fladdermöss visas i kolumnerna 9−11.
| Djur | Arter | Kroppsvikt (kg) |
D2Injiceras g) |
Totalt kroppsvatten g) |
Muskelmassa g) |
Kroppsfett massa g) |
Kroppsfett massa (%) |
DXA mager + bmc g) |
DXA fett g) |
DXA fett (%) |
Kommentar |
| 1 | Eptesicus fuscus | 0.0277 | 0.1299 | 34.18 | 46.69 | -19.02 | -68.74 | 9.90 | 26.55 | 62.80 | Ekvivalentionstiden otillräcklig |
| 2 | Eptesicus fuscus | 0.0185 | 0.0810388 | 64.23 | 87.75 | -69.25 | -374.33 | 14.20 | 17.30 | 17.95 | Full dos injiceras inte |
| 3 | Eptesicus fuscus | 0.0164 | 0.0719 | 17.38 | 23.74 | -7.33 | -44.68 | 14.15 | 14.40 | 1.70 | Mindre än 3% fett |
| 4 | Eptesicus fuscus | 0.0212 | 0.0994 | 54.57 | 74.54 | -53.37 | -252.0 | 16.41 | 19.01 | 13.65 | Bat blev torpid (cool att röra) |
Tabell 3: Kroppssammansättning av stora bruna fladdermöss. Representativa resultat från fladdermöss som inte fick hela dosen av deuteriumoxid, blev torpid under jämviktsfasen, fladdermöss med onormalt stor fettmassa och minimal muskelmassa, eller fladdermöss under 3%−5% kroppsfett som bestäms av DXA. De representativa resultaten av total kroppsvatten, muskelmassa och kroppsfett enligt deuteriumoxidutspädning visas i kolumnerna 5−8. Representativa resultat av muskelmassan plus benmineralhalt och kroppsfett enligt DXA:s beslut visas i kolumnerna 9−11.
| Block | Arter | Kroppsvikt (kg) |
D2Injiceras g) |
Totalt kroppsvatten (kg) |
Muskelmassa (kg) |
Kroppsfett massa (kg) |
Kroppsfett massa (%) |
Daglig vattenförbrukning (mL/dag) |
Kostbehandling |
| 1 | Felis Catus | 4.830 | 3.36 | 2.69 | 3.68 | 1.149 | 23.8 | 96.8 | Kontroll |
| 2 | Felis Catus | 4.764 | 3.45 | 2.66 | 3.63 | 1.136 | 23.8 | 217.5 | Hög fukt |
| 3 | Felis Catus | 4.727 | 3.25 | 2.50 | 3.41 | 1.314 | 27.8 | 125.1 | Hög Selen |
Tabell 4: Kroppssammansättning och vattenförbrukning i ett enda kattdjur. Representativa resultat av deuteriumoxid utspädningsteknik för att bedöma muskelmassa, fettmassa, och vattenförbrukning av en katt vid tre olika tidpunkter under studien som genomfördes av Hooper et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av deuteriumoxid för att bestämma TBW har använts sedan 1940-talet17 och används till människor och en mängd olika inhemska arter och djurarter4,6,7. Andra icke-förstörande tekniker har utvecklats, inklusive bioelektrisk impedansanalys (BIA), DXA och kvantitativ magnetisk resonans (QMR). Varje metod har fördelar och nackdelar som bör beaktas innan man väljer en viss metod för att bedöma kroppssammansättning. Detta protokoll valt att använda DXA som en jämförelsemetod för deuteriumoxid för att bedöma kroppssammansättning, eftersom utrustningen finns som en kärnteknisk resurs med minimal kostnad krävs minimal tid per skanning (30 s per fladdermus), och det är inte känsligt för variabler som kroppstemperatur och hudisolering.
Vid anpassning av deuteriumoxidutspädningstekniken till en art av intresse bör en pilotstudie inledas för att fastställa den tid som krävs för ekvibiration18. Detta kan göras genom att ta ett bakgrundsprov, och ett blodprov var 15 minuter efter injektionen. För små arter som fladdermöss kan flera fladdermöss avblodas med de olika tidsintervallen istället för ett enda djur18. Jämviktstiden kan ändras när djur, såsom fladdermöss, går in i torpor, vilket förklarar varför några av våra djur hade en negativ procent kroppsfett(tabell 3). Om en negativ procent kroppsfett erhålls, och deuterium dosen hade tillräckligt med tid att fullt jämvikt med djurets kroppsvatten, är det troligt att dosen inte var helt injiceras. Eftersom deuteriumoxidutspädningstekniken är starkt beroende av att hela dosen administreras och korrekt registrering av mängden deuterium som injiceras, bör denna teknik endast slutföras av individer som är skickliga på att utföra injektioner. Dessutom kan bedövningsmedel eller sedating djur hjälpa till med att säkerställa att hela dosen kan administreras.
Vid administrering av deuteriumoxiden är det viktigt att bestämma en lämplig koncentration som ska administreras till djuret. Med en dos på 0,7 g/kg för katterna var lagerlösningskoncentrationen lämplig, medan en dos på 0,75 g/kg krävde att lagerlösningen av deuteriumoxid skulle spädas ut. Vid spädning av lagerlösningen bör en isotonisk lösning som 0,9% NaCl användas. För att undvika att ändra det totala kroppsvattnet hos små däggdjur, späd dosen av deuteriumoxid så minimalt som möjligt, precis tillräckligt för att säkerställa att dosen kan mätas korrekt.
De doser som presenteras här är detekterbara med FTIR spektrometri. FTIR spektrometri är billigare och lättare att underhålla, men inte lika känslig som isotop förhållandet masspektrometri (IRMS)19,20. FTIR spektrometri kan användas för att mäta deuterium anrikning i plasma och saliv, men det rekommenderas inte att använda en FTIR transmissionscell för att analysera deuterium anrikning i urin19. Om urin är önskad provtyp bör en försvagad total reflektion (ATR) tillsats användas tillsammans med FTIR eller IRMS för att bedöma deuteriumanrikning vid beräkning av TBW19.
Dessutom var de doser som används för katterna tillräckliga för att tillåta detektion av deuteriumoxid 14 dagar efter injektionen. Eftersom koncentrationen av deuteriumoxiden 14 dagar efter injektionen kunde detekteras, kunde katternas vattenförbrukning beräknas(figur 4). Denna innovativa användning av deuteriumoxid kan användas i fältstudier för att mäta kroppsvattenomsättningen för arter med hög återfångst eller för djur som är inrymt i grupper i ex situ- eller laboratoriestudier. Innan forskarna använder sig av fältstudier måste dock forskarna bedöma om djuret kan fångas upp och hållas under hela jämviktsperioden. Denna förlängningshanteringsperiod är en av nackdelarna med deuteriumoxidtekniken och kan vara problematisk eftersom många utrotningshotade arter tillåter begränsa den tid som ett visst djur kan hållas. Dessutom kan djur inte nyligen ha ätit eftersom washout-tekniken bygger på mätning av kroppsmassa; Därför kan en måltid nyligen förvirra resultaten. En ytterligare ersättning är om ett djur måste vara sövd eller sövd för subkutan injektion och blodsamlingar eller om djuret kan hållas tillbaka utan sedering/anestesi. Det har föreslagits att graden av kroppsvatten omsättning kan vara en betydande indikator för människors hälsa21. Den ökade vattenförbrukningen hos katt 5(figur 4)dokumenterades innan traditionella biokemiska märken av njursvikt, och koncentrationerna av kreatinin och blodurea kväve (BUN) var förhöjda, vilket tyder på att kroppsvattenomsättningen också kunde vara en indikator på hälsa hos djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av MDC Cooperative Agreement (#416), US Forest Service Cooperative Agreement (16-JV-11242311-118), American Academy of Veterinary Nutrition och Waltham / Royal Canin, USA Grant (bidragsnummer: 00049049), NIH utbildningsbidrag (bidragsnummer: T32OS011126) och University of Missouri Veterinary Research Scholars Program. Författarna tackar Shannon Ehlers för att pre-granska detta manuskript. Vi tackar Dr Robert Backus för att ge D2O standarder och tillåta användning av hans laboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 micron non-pyrogenic disk filter | Argos Technologies | FN32S | nylon, 30mm diameter, 0.22um, sterile |
| 1.5 mL conical microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-9701 | 1.5 ml self-standing microcentrifuge tube, natural with blue cap |
| 10 mL sterile glass vial for injection | Mountainside Medical Equipment | MS-SEV10 | clear, sterile glass injection unit |
| 10 mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | sterile 10 mL syringe individually wrapped |
| 100 mL sterile glass vial for injection | Mountainside Medical Equipment | AL-SV10020 | clear, sterile glass injection unit |
| 20 gauge needle | Exel | 26417 | needles hypodermic 20g x 1" plastic hub (yellow) / regular bevel |
| 22 gauge needle | Exel | 26411 | needles hypodermic 22g x 1" plastic hub (black) / regular bevel |
| deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-25G | 99.9 atom % D |
| isofluorane | Vetone | 3060 | fluriso isoflurane, USP |
| OMNIC Spectra Software | ThermoFisher Scientific | 833-036200 | FT-IR standard software |
| petroleum jelly | Vaseline | 305212311006 | Vaseline, 100% pure petroleum jelly, original, skin protectant |
| plastic capillary tubes | Innovative Med Tech | 100050 | sodium heparin anticoagulant, 50 μL capacity, 30 mm length |
| Sealed liquid spectrophotometer SL-3 FTIR CAF2 Cell | International Crystal Laboratory | 0005D-875 | 0.05 mm Pathlength |
| sodium chloride | EMD Millipore | 1.37017 | suitable for biopharmaceutical production |
| Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Spectrometer | ThermoFisher Scientific | 269-169400 | discontinued model, newer models available |
References
- Schiffmann, C., Clauss, M., Hoby, S., Hatt, J. M. Visual body condition scoring in zoo animals – composite, algorithm and overview approaches. Journal of Zoo Aquarium Research. 5 (1), (2017).
- Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
- Bissell, H. Body Condition Scoring Resource Center. , https://nagonline.net/3877/body-condition-scoring/ (2017).
- McWilliams, S. R., Whitman, M. Non-destructive techniques to assess body composition of birds: a review and validation study. Journal of Ornithology. 154 (3), 597-618 (2013).
- Lukaski, H. C., Johnson, P. E. A simple, inexpensive method of determining total body water using a tracer dose of D2O and infrared absorption of biological fluids. American Journal of Clinical Nutrition. 41 (2), 363-370 (1985).
- Chusyd, D. E., et al. Adiposity and Reproductive Cycling Status in Zoo African Elephants. Obesity (Silver Spring). 26 (1), 103-110 (2018).
- Kanchuk, M. L., Backus, R. C., Calvert, C. C., Morris, J. G., Rogers, Q. R. Neutering Induces Changes in Food Intake Body Weight, Plasma Insulin and Leptin Concentrations in Normal and Lipoprotein Lipase–Deficient Male Cats. The Journal of Nutrition. 132 (6), 1730S-1732S (2002).
- Eichhorn, G., Visser, G. H. Technical Comment: Evaluation of the Deuterium Dilution Method to Estimate Body Composition in the Barnacle Goose: Accuracy and Minimum Equilibration Time. Physiological and Biochemical Zoology. 81 (4), 508-518 (2008).
- Hooper, S. E., Backus, R., Amelon, S. Effects of dietary selenium and moisture on the physical activity and thyroid axis of cats. Journal of Animal Physiolgy and Animal Nutrition (Berl). 102 (2), 495-504 (2018).
- Stevenson, K. T., van Tets, I. G. Dual-Energy X-Ray Absorptiometry (DXA) Can Accurately and Nondestructively Measure the Body Composition of Small, Free-Living Rodents. Physiological and Biochemical Zoology. 81 (3), 373-382 (2008).
- Jennings, G., Bluck, L., Wright, A., Elia, M. The use of infrared spectrophotometry for measuring body water spaces. Clinical Chemistry. 45 (7), 1077-1081 (1999).
- Beuth, J. M. Body Composition, movemement phenology and habitat use of common eider along the southern new england coast. Master of Science in Biological and Environmental Sciences (MSBES) thesis. , University of Rhode Island. (2013).
- Coplen, T. B., Hopple, J., Peiser, H., Rieder, S. Compilation of minimum and maximum isotope ratios of selected elements in naturally occurring terrestrial materials and reagents. U.S. Geological Survey Water-Resources Investigations Report 01-4222. , (2002).
- Karasov, W. H., Pinshow, B. Changes in lean mass and in organs of nutrient assimilation in a long-distance passerine migrant at a springtime stopover site. Physiological Zoology. 71 (4), 435-448 (1998).
- Hood, W. R., Oftedal, O. T., Kunz, T. H. Variation in body composition of female big brown bats (Eptesicus fuscus.) during lactation. Journal of Comparative Physiology B. 176 (8), 807-819 (2006).
- Backus, R. C., Havel, P. J., Gingerich, R. L., Rogers, Q. R. Relationship between serum leptin immunoreactivity and body fat mass as estimated by use of a novel gas-phase Fourier transform infrared spectroscopy deuterium dilution method in cats. American Journal of Veterinary Research. 61 (7), 796-801 (2000).
- Moore, F. D. Determination of Total Body Water and Solids with Isotopes. Science. 104 (2694), 157-160 (1946).
- Voigt, C., Cruz-Neto, A. Ecological and Behavioral Methods in the Study of Bats. Parsons, S., Kunz, T. H. , John Hopkins University Press. Ch. 30 621-645 (2009).
- International Atomic Energy Agency. Assessment of Body Composition and Total Energy Expenditure in Humans Using Stable Isotope Techniques. , (2009).
- International Atomic Energy Agency. Introduction to Body Composition Assessment Using the Deuterium Dilution Technique with Analysis of Saliva Samples by Fourier Transform Infrared Spectrometry. , (2011).
- Shimamoto, H., Komiya, S. The Turnover of Body Water as an Indicator of Health. Journal of Physiological Anthropology and Applied Human Science. 19 (5), 207-212 (2000).
