Analyse van combinatoriële miRNA behandelingen te reguleren celcyclus en angiogenese
Summary
miRNA therapeutics hebben aanzienlijke potentieel bij het reguleren van de progressie van kanker. Hier gedemonstreerd worden analytische benaderingen gebruikt voor de identificatie van de activiteit van een combinatorische miRNA behandeling in het stoppen van de celcyclus en angiogenese.
Abstract
Longkanker (LC) is de belangrijkste oorzaak van kanker sterfgevallen wereldwijd. Gelijkaardig aan andere kankercellen, een fundamenteel kenmerk van LC cellen is ongereguleerde proliferatie en celdeling. Remming van de proliferatie door stopzetting van de celcyclus is aangetoond dat een veelbelovende benadering voor de behandeling van kanker, met inbegrip van LC.
miRNA therapeutics opgedoken als belangrijk post-transcriptional gene regelgevers en worden steeds bestudeerd voor gebruik in de behandeling van kanker. In recente werk gebruikt wij twee miRNAs, miR-143 en miR-506, voor het regelen van de celcyclus. A549 niet-kleincellige longkanker (NKCLK) kankercellen waren transfected, gen expressie veranderingen werden geanalyseerd en apoptotic activiteit als gevolg van de behandeling was ten slotte geanalyseerd. Downregulatie van cycline-afhankelijk kinases (CDKs) werden gedetecteerd (dat wil zeggen, CDK1, CDK4 en CDK6) en celcyclus halt bij de G1/S en G2/M fase-overgangen. Analyse van het traject aangegeven potentiële antiangiogenic activiteit van de behandeling, dat de aanpak met veelzijdige activiteit schenkt. Hier beschreven zijn de methoden voor het identificeren van miRNA activiteit met betrekking tot de celcyclus remming, inductie van apoptosis en effecten van behandeling op de endotheliale cellen door remming van angiogenese. Gehoopt wordt dat de hier gepresenteerde methoden toekomstig onderzoek op miRNA therapeutics en overeenkomstige activiteit steunen zullen en dat de representatieve gegevens andere onderzoekers tijdens de experimentele analyses begeleiden zal.
Introduction
De celcyclus is een combinatie van meerdere regelgevende gebeurtenissen waarmee verdubbeling van DNA en cel proliferatie door middel van de mitotische proces1. Cycline-afhankelijk kinases (CDKs) regelen en bevorderen van de celcyclus2. Onder hen hebben de mitotische CDK (CDK1) en de interfase CDKs (CDK2, CDK4 en CDK6) een sleutelrol in de celcyclus progressie3. Eiwit Retinoblastoom (Rb) is door de CDK4/CDK6 complex dat celcyclus progressie4phosphorylated, en CDK1 activering is essentieel voor succesvolle celdeling5. Talrijke CDK-remmers zijn ontwikkeld en geëvalueerd in klinische proeven in de afgelopen paar decennia, met vermelding van het potentieel van de doelgerichtheid van CDKs in de behandeling van kanker. In feite, drie CDK-remmers zijn goedgekeurd voor de behandeling van kanker van de borst onlangs6,7,8,9,10. Dus, CDKs, en in het bijzonder, CDK1 en CDK4/6, zijn van groot belang bij het reguleren van de progressie van kanker cellen.
miRNAs (miRs) zijn kleine, niet-coderende RNAs en post-transcriptional regulatoren van genexpressie, regulering van ongeveer 30% van alle menselijke genen11. Hun activiteit is gebaseerd op translationeel onderdrukking of afbraak van messenger RNAs (mRNAs)12. Illustratief voor hun biologische betekenis, meer dan 5.000 miRNAs geconstateerd en een enkele miRNA molecuul kan meerdere genen11,13regelen. MiRNA expressie geweest en wat nog belangrijker is, gekoppeld aan verschillende ziekten en ziekte statussen, met inbegrip van kanker13. In feite, miRNAs hebben gekenmerkt als oncogene of tumor suppressors, kunnen bevorderen of onderdrukken tumor ontwikkeling en progressie14,15. De relatieve uitdrukking van miRNAs in zieke weefsels kan reguleren de progressie van de ziekte; exogene levering van miRNAs heeft dus therapeutisch potentieel.
Longkanker is de belangrijkste oorzaak van sterfgevallen ten gevolge van kanker en groter is dan 60% van alle longen maligniteiten non-small zijn cell lung kankers16,17, met een 5-jaars overlevingskansen van minder dan 20%18. Het gebruik van miR-143-3 p en miR-506-3 p is onlangs geëvalueerd voor de cel cycli in long kanker cellen11targeting. miR-143 en miR-506 sequenties die complementariteit te CDK1 en CDK4/CDK6 en de gevolgen van deze twee miRs voor A549 cellen werden geanalyseerd. De experimentele gegevens worden gepresenteerd en in dit Groenboek besproken. Genexpressie, celcyclus en apoptosis werden geëvalueerd aan de hand van verschillende experimentele designs en timepoints na transfectie. We gebruikten real-time kwantitatieve PCR (RT-qPCR) methoden samen met microarray analyse voor het meten van specifieke genexpressie, en volgende-generatie RNA sequencing werd gebruikt om te bepalen van globale gene disregulatie11. De laatste methode geeft de relatieve overvloed van afschrift van elk gen met hoge gevoeligheid en reproduceerbaarheid, terwijl duizenden genen van een enkele experimentele analyse kunnen worden geanalyseerd. Bovendien apoptotic analyse als gevolg van miRNA behandeling werd uitgevoerd en hier wordt beschreven. Bioinformatics aangevuld de route-analyse. Hier gepresenteerd worden protocollen gebruikt voor analyse van het therapeutisch potentieel van de combinatorische miR-143 en miR-506.
Het hoofddoel van dit protocol is de effecten van miRNAs in cellen, met een focus op de celcyclus te kunnen identificeren. Het scala aan technieken gepresenteerd hier span van gen expressie analyse voorvertaling (met qPCR) om te werken en nieuwe technieken voor genetische analyse op het niveau van eiwitten, zoals microarray analyse. Gehoopt wordt dat dit verslag nuttig voor onderzoekers die geïnteresseerd is in het werken met miRNAs. Bovendien wordt methodologie voor flow cytometrische analyse van de celcyclus en apoptosis van cellen gepresenteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNAs kan functioneren als gerichte therapieën voor de behandeling van kanker, herkennen de disregulatie van expressie niveaus in zieke vs. normale weefsels. Deze studie gericht op het bepalen van de miRNAs die potentieel celcyclus tijdens meerdere fasen stoppen. Het werd ontdekt dat miR-143 en miR-506 de celcyclus van kankercellen, en de voorgestelde protocollen gericht op het begrijpen van de activiteit van deze combinatorische miRNA behandeling stoppen.
De beschreven methoden geven een ov…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen belangenconflicten worden gedeclareerd.
Materials
| -80 °C Freezer | VWR | VWR40086A | |
| 96 well plate | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96-well Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Bright field microscope | Microscoptics | IV-900 | |
| Bright field microscope | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle phase and for calculating the population distribution for the analysis of apoptosis | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | CFX96 Optics Module | |
| Chemidoc Touch Imaging System | BioRad | Chemidoc Touch Imaging System | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Digital Camera | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Ethidium bromide | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Fetal Bovine Serum – Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II water Jacket CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Heparin Solution (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Horixontal Electrophoresis system | Benchtop lab system | BT102 | |
| hsa-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| hsa-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Individual donors | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results: Used for bioinformatics pathway analysis | |
| Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Loading dye 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscope Digital Camera | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Penicillin-streptomycin 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm. | |
| q PCR optical adhesive cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A from Bovine pancreas | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Step 7.33: Microarray analysis software | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml | VWR | 470224-998 | |
| SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Buffer, 20x liquid | VWR | 10791-796 | |
| Temperature controlled centrifuge matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Temperature controlled micro centrifuge matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Ultra Low Range DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR standard solid door laboratory refrigerator | VWR |
Riferimenti
- Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
- Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090 (2016).
- Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769 (2015).
- Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
- Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
- Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
- Mullard, A. FDA approves Novartis’s CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229 (2017).
- Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
- Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495 (2018).
- Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
- Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
- Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Biologia dello sviluppo. 302 (1), 1-12 (2007).
- Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004 (2016).
- Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543 (2017).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. . Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078 (2018).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
- Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
- Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
- Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
- Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004 (2001).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, 21 (2013).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860 (2013).
