Analyse der kombinatorischen MiRNA Behandlungen zur Regulierung des Zellzyklus und Angiogenese
Summary
MiRNA-Therapeutika haben erhebliches Potenzial bei der Regulierung der Tumorprogression. Hier demonstriert werden analytische Ansätze zur Identifikation der Aktivität einer kombinatorischen MiRNA-Behandlung in der Eindämmung des Zellzyklus und Angiogenese verwendet.
Abstract
Lungenkrebs (LC) ist die führende Ursache von Krebs-in Verbindung stehenden Todesfälle weltweit. Ähnlich wie bei anderen Krebszellen, ist ein wesentliches Merkmal des LC Zellen unkontrollierte Proliferation und Zellteilung. Hemmung der Proliferation von Zellzyklus Fortschreiten zu stoppen hat gezeigt, ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung von Krebs, einschließlich LC.
MiRNA Therapeutika sind als wichtige posttranskriptionelle gen Regulatoren entstanden und werden zunehmend für den Einsatz in der Krebstherapie untersucht. In den letzten Arbeiten haben wir zwei MiRNAs, MiR-143 und MiR-506, zur Regulierung des Zellzyklus Progression verwendet. A549 nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) Krebszellen wurden transfiziert gen Ausdruck Änderungen wurden analysiert und apoptotische Aktivität aufgrund der Behandlung war schließlich analysiert. Herabregulation von cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) erkannt wurden (d. h. CDK1, CDK4 und CDK6), und den Zellzyklus gestoppt an den Phasenübergängen G1/S und G2/M. Pathway Analyse zeigte mögliche Anti-angiogenetische Tätigkeitsbereich die Behandlung, die das Konzept mit vielfältigen Aktivitäten verleiht. Hier beschrieben, sind die Methoden zur Identifikation von MiRNA Tätigkeit betreffend Zellzyklus Hemmung, Induktion der Apoptose und Auswirkungen der Behandlung auf Endothelzellen durch Hemmung der Angiogenese. Es ist zu hoffen, dass die hier vorgestellten Methoden Zukunftsforschung auf MiRNA Therapeutika und entsprechende Aktivität unterstützen und die repräsentativen Daten andere Forscher während experimentelle Analysen leiten werden.
Introduction
Der Zellzyklus ist eine Kombination aus mehreren regulatorischen Ereignisse, die Vervielfältigung der DNA und Zellproliferation durch den mitotischen Prozess1ermöglichen. Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) regulieren und fördern die Zellzyklus-2. Unter anderem haben die mitotische CDK (CDK1) und Interphase CDKs (CDK2, CDK4 und CDK6) eine zentrale Rolle im Zellzyklus Progression3. Retinoblastom-Protein (Rb) ist von der CDK4/CDK6 komplexe erlauben Zellzyklus Fortschreiten4phosphoryliert und CDK1 Aktivierung ist unerlässlich für erfolgreiche Zellteilung5. Zahlreiche CDK-Inhibitoren wurden entwickelt und bewertet in klinischen Studien in den letzten Jahrzehnten zeigt das Potenzial des Zielens CDKs in der Krebsbehandlung. In der Tat drei CDK-Inhibitoren zur Behandlung von Brustkrebs genehmigt worden vor kurzem6,7,8,9,10. So CDKs und insbesondere CDK1 und CDK4/6, sind von großem Interesse bei der Regulierung der Zelle Tumorprogression.
MiRNAs (MiRs) sind kleine, nicht-kodierende RNAs und posttranskriptionelle Regulatoren der Genexpression, Regulierung von ca. 30 % aller menschlichen Gene11. Ihre Tätigkeit basiert auf translationale Repression oder zum Abbau von Messenger-RNAs (mRNAs)12. Beispielhaft für ihre biologische Bedeutung, mehr als 5.000 MiRNAs wurden identifiziert und ein einzelnes MiRNA-Molekül kann mehrere Gene11,13regulieren. Noch wichtiger ist, wurde MiRNA Ausdruck verschiedener Krankheiten und Zustände von Krankheit, einschließlich Krebs13zugeordnet. In der Tat MiRNAs haben so onkogenen gekennzeichnet worden oder Tumor-Suppressoren, fähig zu fördern oder zu unterdrücken Tumor Entwicklung und Progression14,15. Die relative Expression von MiRNAs in erkrankten Geweben kann Fortschreiten der Krankheit regulieren; so hat die exogene Lieferung von MiRNAs therapeutisches Potenzial.
Lungenkrebs ist die häufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle und mehr als 60 % aller malignen Erkrankungen Lunge nicht klein sind Zelle Lungenkrebs Krebs16,17, mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 20 %18. Die Verwendung von MiR-143-3 p und MiR-506-3 p wurde vor kurzem für die Ausrichtung der Zelle Zyklen in der Lunge Krebs Zellen11bewertet. MiR-143 und MiR-506 Sequenzen, die Komplementarität CDK1 und CDK4/CDK6 sind, und die Auswirkungen dieser beiden MiRs auf A549 Zellen wurden analysiert. Die experimentelle Details werden vorgestellt und diskutiert in diesem Papier. Genexpression, Zellzyklus Progression und Apoptose wurden mit verschiedenen experimentellen Designs und Zeitpunkte nach Transfektion ausgewertet. Wir Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) Methoden zusammen mit Microarray-Analyse zur Messung der spezifischen Gen-Expression und RNA Sequenzierung der nächsten Generation wurde verwendet, um globale gen Dysregulation11bestimmen. Die letztere Methode identifiziert die relative Häufigkeit jedes Gen Abschrift mit hoher Sensitivität und Reproduzierbarkeit, während Tausende von Genen aus einer einzigen experimentellen Analyse analysiert werden können. Darüber hinaus Apoptotic Analyse aufgrund der MiRNA-Behandlung wurde durchgeführt und wird hier beschrieben. Bioinformatik ergänzt die Pfad-Analyse. Hier werden Protokolle zur Analyse der das therapeutische Potenzial der kombinatorischen MiR-143 und MiR-506 verwendet.
Der Hauptzweck dieses Protokolls ist es, die Auswirkungen von MiRNAs in Zellen, mit einem Fokus auf den Zellzyklus. Die Vielfalt der Techniken hier vorgestellten Spanne von gen Expressionsanalyse Vorübersetzung (mit qPCR) zu erarbeiten und neue Techniken für die Genanalyse auf Proteinebene, wie Microarray-Analyse. Es ist zu hoffen, dass dieser Bericht hilfreich für Forscher in Zusammenarbeit mit MiRNAs interessiert ist. Darüber hinaus präsentiert Methodik zur durchflusszytometrischen Analyse des Zellzyklus und Apoptose der Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
MiRNAs können agieren als zielgerichtete Therapien zur Behandlung von Krebs, erkennen die Dysregulation der Ausdruck Ebenen in erkrankten vs. normale Gewebe. Diese Studie soll MiRNAs zu bestimmen, die potenziell Zellzyklus Fortschreiten in mehreren Phasen zu stoppen. Es wurde festgestellt, dass MiR-143 und MiR-506 stoppen den Zellzyklus der Krebszellen und der vorgestellten Protokolle zielte darauf ab, die Aktivität dieser kombinatorischen MiRNA-Behandlung zu verstehen.
Die beschriebenen Met…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Keine Interessenkonflikte werden erklärt.
Materials
| -80 °C Freezer | VWR | VWR40086A | |
| 96 well plate | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96-well Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Bright field microscope | Microscoptics | IV-900 | |
| Bright field microscope | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle phase and for calculating the population distribution for the analysis of apoptosis | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | CFX96 Optics Module | |
| Chemidoc Touch Imaging System | BioRad | Chemidoc Touch Imaging System | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Digital Camera | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Ethidium bromide | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Fetal Bovine Serum – Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II water Jacket CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Heparin Solution (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Horixontal Electrophoresis system | Benchtop lab system | BT102 | |
| hsa-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| hsa-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Individual donors | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results: Used for bioinformatics pathway analysis | |
| Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Loading dye 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscope Digital Camera | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Penicillin-streptomycin 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm. | |
| q PCR optical adhesive cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A from Bovine pancreas | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Step 7.33: Microarray analysis software | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml | VWR | 470224-998 | |
| SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Buffer, 20x liquid | VWR | 10791-796 | |
| Temperature controlled centrifuge matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Temperature controlled micro centrifuge matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Ultra Low Range DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR standard solid door laboratory refrigerator | VWR |
Riferimenti
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