Inactivation chimique de l'E3 Ubiquitin Ligase Cereblon par des Homo-PROTAC à base de Pomalidomide
Summary
Ce travail décrit la synthèse et la caractérisation d’un homo-PROTAC bifonctionnel à base de pomalidomide comme une nouvelle approche pour induire l’ubiquitination et la dégradation du cereblon de ligase d’ubiquitine E3 (CRBN), la cible des analogues de la thalidomide.
Abstract
Les médicaments immunomodulatoires (IMiDs) thalidomide et ses analogues, lénalidomide et pomalidomide, tous les médicaments approuvés par la FDA pour le traitement du myélome multiple, induire l’ubiquitination et la dégradation des facteurs de transcription lymphoïde Ikaros (IKZF1) et Aiolos (IKZF3) via le cereblon (CRBN) E3 ubiquitin ligase pour la dégradation protéasomal. IMiDs ont récemment été utilisés pour la génération de chiolyse bifonctionnelle ciblant les chimères (PROTACs) pour cibler d’autres protéines pour l’ubiquitination et la dégradation protéasomal par la ligase CRBN E3. Nous avons conçu et synthétisé des PROTAC homobifonctionnels à base de pomalidomide et analysé leur capacité à induire l’ubiquitination autodirigée et la dégradation de CRBN. Ici, CRBN sert à la fois, la ligase d’ubiquitine E3 et la cible en même temps. Le composé homo-PROTAC 8 dégrade CRBN avec une puissance élevée avec seulement des effets restants minimes sur IKZF1 et IKZF3. L’inactivation de CRBN par le composé 8 n’a eu aucun effet sur la viabilité et la prolifération de cellules multiples différentes. Cet homo-PROTAC abroge les effets des IMiD dans plusieurs cellules de myélome. Par conséquent, nos composés homodimériuns à base de pomalidomide peuvent aider à identifier les substrats endogènes et les fonctions physiologiques de CRBN et à étudier le mécanisme moléculaire des MiD.
Introduction
Les médicaments immunomodulateurs (IMiDs) thalidomide et ses analogues, lénalidomide et pomalidomide, tous approuvés pour le traitement du myélome multiple, se lient à l’E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN), un adaptateur de substrat pour cullin4A-RING E3 ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. La liaison des IMiD améliore l’affinité du CRL4CRBN aux facteurs de transcription lymphoïde Ikaros (IKZF1) et Aiolos (IKZF3), conduisant à leur ubiquitination et dégradation (Figure 1)4,5, 6 Annonces , 7 Annonces , 8. Puisque IKZF1 et IKZF3 sont essentiels pour les cellules de myélome multiples, leur inactivation a comme conséquence l’inhibition de croissance. SALL4 a été récemment trouvé comme un néo-substrat iMiD-induit supplémentaire de CRBN qui est probablement responsable de la tératogénicité et la catastrophe dite Contergan dans les années 1950 causée par la thalidomide9,10. En revanche, la caséine 1 (CK1) est un substrat spécifique au lénalidomide de CRBN qui est impliqué dans l’effet thérapeutique dans le syndrome myélodydyplasique avec des suppressions de chromosome 5q11.
La capacité des petites molécules à cibler une protéine spécifique pour la dégradation est une implication passionnante pour le développement de médicaments modernes. Alors que le mécanisme de la thalidomide et de ses analogues a été découvert après leur première utilisation chez l’homme, ce qu’on appelle Proteolyse Targeting Chimeras (PROTACs) ont été conçus pour cibler spécifiquement une protéine d’intérêt (POI) (Figure 2)12,13,14,15,16,17,18. Les PROTAC sont des molécules hétérophobes qui se composent d’un ligand spécifique pour le POI connecté via un linker à un ligand d’une ligase d’ubiquitine E3 comme CRBN ou von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Les PROTAC induisent la formation d’un complexe ternaire transitoire, dirigeant le POI à la ligase d’ubiquitine d’E3, ayant pour résultat son ubiquitination et la dégradation protéasomal. Les principaux avantages des PROTAC par rapport aux inhibiteurs conventionnels sont que la liaison à un POI est suffisante plutôt que son inhibition et, par conséquent, les PROTAC peuvent potentiellement cibler un spectre beaucoup plus large de protéines, y compris celles qui ont été considérées comme non médicamentables comme facteurs de transcription15. En outre, les molécules chimériques agissent catalytiquement et ont donc une puissance élevée. Après le transfert d’ubiquitine au POI, le complexe ternaire se dissocie et est disponible pour la formation de nouveaux complexes. Ainsi, de très faibles concentrations PROTAC sont suffisantes pour la dégradation de la protéine cible23.
Ici nous décrivons la synthèse d’un homo-PROTAC conjugué pomalidomide-pomalidomide (composé 8) qui recrute CRBN pour la dégradation de lui-même24. L’E3 ubiquitine ligase CRBN sert à la fois de recruteur et de cible en même temps (figure 3). Pour valider nos données, nous avons également synthétisé un contrôle de liaison négatif (composé 9). Nos données confirment que l’homo-PROTAC nouvellement synthétisé est spécifique à la dégradation du CRBN et n’a que des effets minimes sur d’autres protéines.
Protocol
Representative Results
Discussion
La conception de ces homo-PROTAC tel que décrit ici pour CRBN repose sur l’affinité spécifique de la pomalidomide à CRBN, qui a été utilisée avec succès dans de nombreux PROTAC hétérofunctional et a abouti au développement de PROTAC 8 comme un très crBN sélectif de grader. La spécificité de notre molécule a déjà été confirmée par des analyses protéomiques24. Pour les KO génétiquement médiatisés, l’exclusion et la validation des effets secondaires est diff…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 et SFB-1074 à J.K.; FOR2372 à M.G.)
Materials
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
Riferimenti
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
- Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
- Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
- Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
- Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
- Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
- Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
- Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
- Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
- Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
- Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
- Schneekloth, J. S., et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
- Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
- Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
- Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
- Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
- Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
- Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
- Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
- Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
- Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
- Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
- Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
- Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
- Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
- Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
- Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
- Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
- Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
- Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).
