עבודה זו מתארת את הסינתזה והאפיון של המבוסס על המוח, bifunctional הומו-protac כגישה הרומן כדי לגרום אובילינציה והשפלה של E3 אוביקוויב ליגאז המוח (crbn), המטרה של תלידומיד אנלוגיים gs.
התרופות האימונומודולטוריים (שפוניים) תלידומיד ו האנלוגית שלה, lenalidomide ו pomalidomide, כל ה-FDA אישר תרופות לטיפול מיאלומה נפוצה, לגרום אוביקווינציה והשפלה של שעתוק הלימפה הגורמים אימוס (IKZF1) ו aiolos (IKZF3) באמצעות המוח (crbn) E3 אוביקוויב ליגאז עבור השפלה פרוטאספאואל. הסרדים לאחרונה כבר נוצל עבור הדור של bifunctional פרוטפוליזיס מיקוד הצ (PROTACs) כדי למקד חלבונים אחרים עבור אוביקווינציה ו השפלה פרוטאספאל על ידי CRBN E3 ligase. עיצבנו ו מסונתז pomalidomide מבוססי מבוסס PROTACs וניתח את היכולת שלהם כדי לגרום לעצמי אוביקווינציה והשפלה של CRBN. כאן, crbn משמש שניהם, the E3 אוביקוויב ליגאז ואת המטרה באותו זמן. מתחם הומו-פרוטואק 8 מאשר crbn עם עוצמה גבוהה עם השפעות שנותרו מינימליות בלבד על IKZF1 ו IKZF3. Crbn איון פעלה על ידי מתחם 8 לא היתה השפעה על הכדאיות התא והתפשטות של שונים תאים מיאלומה נפוצה. זה הומו-PROTAC abrogates ההשפעות של שפתוכים בתאי מיאלומה נפוצה. לכן, תרכובות מבוססות שלנו pomalidomide שלנו עשוי לסייע לזהות מצעים האנדוגניים של CRBN ופונקציות פיזיולוגיות ולחקור את המנגנון המולקולרי של הפתוכים.
התרופות האימונומודולטוריים (שפתוכים) תלידומיד ו האנלוגית שלה, lenalidomide ו pomalidomide, כל מאושר לטיפול מיאלומה נפוצה, לאגד את המידע e3 אוביקוויב ליגאז (crbn), מתאם מצע עבור cullin4A-RING e3 לליגאז (CRL4crbn)1,2,3. איגוד של הסרדים מגביר את האהדה של CRL4crbn כדי שעתוק הלימפה גורמים אינוס (IKZF1) ו aiolos (IKZF3), המוביל שלהם אוביגינציה והשפלה (איור 1)4,5, מיכל בן 6 , מיכל סבן , 8. מאז IKZF1 ו IKZF3 חיוניים עבור תאים מיאלומה נפוצה, תוצאות חוסר ההפעלה שלהם מעכבות גדילה. SALL4 נמצאה לאחרונה כמו הגנום הניאו המושרה נוסף של crbn כי הוא כנראה אחראי על טראטוגניזה ואת האסון contergan בשנות החמישים שנגרמו על ידי תלידומיד9,10. לעומת זאת, שהקזאין (CK1α) הוא מצע מיוחד של CRBN, שהוא מעורב באפקט הטיפולי בתסמונת המיאלודיספלסטית עם מחיקות 5q של כרומוזום11.
היכולת של מולקולות קטנות למקד חלבון מסוים להשפלה היא רמז מרגש להתפתחות הסמים המודרנית. בעוד המנגנון של תלידומיד ואת האנלוגיות שלה התגלתה לאחר השימוש הראשון שלהם בבני אדם, כך קרא Proteolysis Targeting Chimeras (protacs) תוכננו במיוחד למקד חלבון של עניין (הדמות) (איור 2)12,13,14,15,16,17,18. Protacs הם מולקולות הטרובייוטיות המורכבות של ליגנד עבור פוי מחובר באמצעות מקשר ל ליגו של E3 אוביקוויב ליגאז כמו crbn or פון-היפרפל-ינדאו (vhl)18,19,20, 21,22. PROTACs לגרום להיווצרות של מתחם טרנארי חולף, הנחיית פוי ל-E3 אוביקוויב ligase, וכתוצאה מכך אוביקווינציה שלה והשפלה פרוטאספאואל. היתרונות העיקריים של PROTACs על פני מעכבי קונבנציונלי היא כי קשירה של פוי הוא מספיק ולא העכבות שלה ולכן PROTACs יכול למקד ספקטרום רחב הרבה יותר של חלבונים כולל אלה שנחשבו להיות undruggable כמו גורמים שעתוק15. בנוסף, מולקולות צ’יאריק לפעול באופן מזרז ולכן יש עוצמה גבוהה. לאחר העברת אוביקוויב לנקודת ההפוי, הקומפלקס הטרארי מנתק וזמין להיווצרות מתחמים חדשים. כך, ריכוזי PROTAC נמוך מאוד מספיקים עבור השפלה של חלבון היעד23.
כאן אנו מתארים את הסינתזה של pomalidomide-פוליאנide הומו-PROTAC (מתחם 8) כי המגוייסים עבור השפלה של עצמו24. The E3 אוביקוויט ליגאז crbn משמש הן המגייס ואת המטרה באותו זמן (איור 3). כדי לאמת את הנתונים שלנו, מסונתז גם בקרת מחייב שלילי (מתחם 9). הנתונים שלנו לוודא כי מסונתז הומו-PROTAC החדש הוא ספציפי עבור השפלה CRBN ויש לו רק השפעות מינימליות על חלבונים אחרים.
העיצוב של כזה הומו-PROTACs כפי שתואר כאן עבור CRBN מסתמך על הזיקה הספציפית של pomalidomide כדי CRBN, אשר כבר נוצל בהצלחה ברבים הטרובידותיום PROTACs והביא לפיתוח PROTACS 8 כמו מאוד CRBN degrader סלקטיבית. הספציפיות של המולקולה שלנו כבר אושרה על-ידי ניתוחים פרוטאואריים24. עבור הסתרה מתווכת גנטית, ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו היתה נתמכת על ידי הגרמני של הפרויקט (אמי-נתר התוכנית Kr-3886/2-1 ו-SFB-1074 לג; FOR2372 to מ)
1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |