Etablierung und Charakterisierung von drei Afatinib-resistenten Lungenadenokarzinom PC-9 Zelllinien entwickelt mit zunehmenden Dosen von Afatinib
Summary
Es wurde ein Verfahren zur Etablierung von Afatinib-Resistenz-Zelllinien aus Lungenadenokarzinom-PC-9-Zellen entwickelt und resistente Zellen charakterisiert. Die resistenten Zellen können verwendet werden, um epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Inhibitor-Resistenz-Mechanismen zu untersuchen, anwendbar für Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs.
Abstract
Erworbene Resistenz gegen molekulare Zielhemmer ist ein ernstes Problem in der Krebstherapie. Lungenkrebs ist in den meisten Ländern nach wie vor die häufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle. Die Entdeckung von “onkogenen Treibermutationen”, wie epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR)-aktivierende Mutationen, und die anschließende Entwicklung molekularer gezielter Wirkstoffe von EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKIs) (Gefitinib, Erlotinib, Afatinib, Dacomitinib und Osimertinib) haben die Lungenkrebsbehandlung in den letzten Jahrzehnten dramatisch verändert. Diese Medikamente sind jedoch immer noch nicht wirksam bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), die EGFR-aktivierende Mutationen tragen. Nach erworbener Resistenz bleibt das systemische Fortschreiten von NSCLC ein erhebliches Hindernis bei der Behandlung von Patienten mit EGFR-Mutation-positivem NSCLC. Hier stellen wir eine stufenweise Dosiseskalationsmethode zur Etablierung von drei unabhängigen erworbenen Afatinib-resistenten Zelllinien aus NSCLC PC-9-Zellen vor, die EGFR-aktivierende Mutationen von 15-Basen-Paar-Deletionen in EGFR exon 19 enthalten. Methoden zur Charakterisierung der drei unabhängigen afatinib-widerstandsgebundenen Zelllinien werden kurz vorgestellt. Die erworbenen Resistenzmechanismen gegen EGFR-TKIs sind heterogen. Daher müssen mehrere Zelllinien mit erworbener Resistenz gegen EGFR-TKIs untersucht werden. Zehn bis zwölf Monate sind erforderlich, um Zelllinien mit erworbenem Widerstand mit diesem schrittweisen Dosiseskalationsansatz zu erhalten. Die Entdeckung neuartiger resistenzmechanismen wird zur Entwicklung wirksamerer und sicherer therapeutischer Strategien beitragen.
Introduction
Fünf Tyrosinkinase-Inhibitoren, die auf epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) abzielen, einschließlich Gefitinib, Erlotinib, Afatinib, Dacomitinib und Osimertinib, sind derzeit für die Behandlung von Patienten mit EGFR-Mutation-positiver nicht-kleinzelliger Lunge verfügbar. Krebs (NSCLC). In den letzten zehn Jahren haben sich Therapien für solche Patienten mit der Entdeckung neuer potenzieller EGFR-TKIs dramatisch entwickelt. Bei Patienten mit Lungenadenokarzinom wurden somatische Mutationen in EGFR bei etwa 50%der asiatischen und 15% der kaukasischen Patienten 1 identifiziert. Die häufigsten Mutationen in EGFR sind eine L858R-Punktmutation bei EGFR exon 21 und 15 Base pair (bp) Deletionen in EGFR exon 192. Bei EGFR-Mutations-positiven Patienten mit NSCLC verbessern EGFR-TKIs die Ansprechraten und klinischen Ergebnisse im Vergleich zum vorherigen Standard der Platin-Doppelchemotherapie3.
Gefitinib und Erlotinib waren die ersten zugelassenen kleinen Molekülinhibitoren und werden im Allgemeinen als EGFR-TKIs der ersten Generation bezeichnet. Diese EGFR TKIs blockieren die Tyrosinkinase-Aktivität, indem sie mit ATP konkurrieren und reversibel an ATP-Bindungsstellen binden4. Afatinib ist ein EGFR-TKI der zweiten Generation, das irreversibel und kovalent an die Tyrosinkinase-Domäne von EGFR bindet und als panhumaner EGFR-Familieninhibitor5charakterisiert ist.
Trotz des dramatischen Nutzens dieser Therapien bei Patienten mit NSCLC ist eine erworbene Resistenz unvermeidlich. Der häufigste Resistenzmechanismus gegen EGFR-TKIs der ersten und zweiten Generation ist die Entstehung der T790M-Mutation in EGFR exon20, die in 50-70% der Tumorproben 6,7,8vorhanden ist. Andere Resistenzmechanismen sind Bypass-Signale (zu MET, IGF1R und HER2), Transformation zu kleinzelligem Lungenkrebs und Induktion epitheliaal-mesenchymaler Übergang, die vorklinisch und klinisch9auftreten. Die Resistenzmechanismen gegen EGFR-TKIs sind heterogen. Durch die Identifizierung neuartiger Resistenzmechanismen in präklinischen Studien kann es möglich sein, neuartige Therapeutika zu entwickeln, um Resistenzen zu überwinden. Optimale Sequenztherapien, die den klinischen Nutzen für die Patienten maximieren, müssen die Resistenzmechanismen und das therapeutische Ziel berücksichtigen.
Es ist zwingend notwendig, die richtige elterliche Zelllinie zu wählen, da sie die Grundlage aller nachfolgenden Experimente ist. Die Auswahlstrategien beginnen mit klinischer Relevanz; es ist notwendig, eine Chemotherapie und Bestrahlung naive Zelllinie zu wählen. Vorherige chemotherapeutische und/oder strahlungstechnische Behandlung kann die Veränderung der Resistenzwege und Veränderungen der Expression von Arzneimittelresistenzmarkern induzieren. In dieser Studie werden PC-9-Zellen, die 15 bp Deletionen in EGFR exon 19 tragen, für die Etablierung der erworbenen Resistenz gegen Afatinib eingesetzt. Diese Zelllinie wurde von einem japanischen NSCLC-Patienten abgeleitet, der keine vorherige Chemotherapie und Bestrahlung erhielt.
Da Afatinib täglich oral verabreicht wird, wäre eine kontinuierliche In-vitro-Behandlung, bei der die Zellen ständig in Gegenwart von Afatinib kultiviert werden, klinisch relevant. Die Dosis der Medikamente, die in den verschiedenen Schritten des Experiments verwendet werden, muss für die ausgewählte Elternzelllinie optimiert werden. Zur Bestimmung eines geeigneten Arzneimittelbereichs kann ein Zytotoxizitätstest verwendet werden, der mit den pharmakokinetischen Informationen des Arzneimittels vergleichbar sein sollte.
Während des gesamten Auswahlprozesses wird die gesamte Zellgesamtheit als eine einzige Gruppe beibehalten. Klonen oder andere Trennmethoden werden nicht verwendet. Die Zellen werden zunächst kontinuierlich einem niedrigen Niveau des Medikaments ausgesetzt. Anschließend, nachdem sich die Zellen anpassen, um in Gegenwart des Medikaments zu wachsen, wird die Dosis des Medikaments langsam auf die endgültige optimale Dosis des Medikaments10,11erhöht. Alternativ kann eine Pulsmedikamenten-Verabreichung oder Mutagenese zur Auswahl von Resistenzzellen verwendet werden, die auch vor der medikamentösen Behandlung durchgeführt werden 12,13. Leider werden Fälle, in denen sich die Arzneimittelresistenz nicht entwickelt, in der Regel nicht gemeldet. Die Selektionsstrategien werden mit dem Ziel entwickelt, die Bedingungen von Krebspatienten für den Wiederaufbau klinisch relevanter Resistenzen nachzuahmen. Manchmal wird eine hohe Arzneimittelkonzentration verwendet, um molekulare Veränderungen im Zusammenhang mit Mechanismen der Arzneimittelresistenz zu identifizieren. Dieses Modell wird weniger klinisch relevant.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Etablierung von drei unabhängigen afatinibresistenten Zelllinien aus PC-9-Zellen, die 15 bp Deletionen in EGFR exon 19 enthalten, sowie die anfängliche Charakterisierung der afatinibresistenten Zelllinien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrieben wir ein Verfahren zur Etablierung von drei unabhängigen afatinibresistenten Zelllinien und charakterisierten diese Zellen im Vergleich zu elterlichen PC-9-Zellen. Durch schrittweise Dosiseskalationsexposition erhielten die elterlichen PC-9-Zellen über einen Zeitraum von 10-12 Monaten eine Resistenz gegen Afatinib. Klinisch sind die Resistenzmechanismen gegen EGFR-TKIs heterogen, so dass PC-9-Zellen nach der Erstbehandlung mit Afatinib in drei unabhängige p100-Gerichte unterteilt und afatinib weiter au…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Mitglied des Advanced Cancer Translational Research Institute für ihre nachdenklichen Kommentare und Editage für ihre Unterstützung bei der englischsprachigen Bearbeitung. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI (Zuschussnummer: 16K09590 an T.Y.) unterstützt.
Materials
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
Riferimenti
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