アファチニブ耐性肺腺癌PC-9細胞株の確立と特徴付けは、アファチニブの用量の増加とともに開発された
Summary
肺腺癌PC-9細胞からアファチニブ耐性細胞株を確立する方法が開発され、耐性細胞が特徴付けられた。耐性細胞は、非小細胞肺癌患者に適用可能な表皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤耐性機構を調製するために使用することができる。
Abstract
分子標的阻害剤に対する後天性耐性は、がん治療において深刻な問題である。肺癌は、ほとんどの国で癌関連死の主要な原因のままです。表皮成長因子受容体(EGFR)-活性化変異などの「発死因子変異」の発見、およびEGFRチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)の分子標的剤のその後の開発(ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ)は、ここ数十年で肺癌治療を劇的に変化させた。しかしながら、これらの薬剤は、EGFR-活性化変異を有する非小細胞肺癌(NSCLC)患者には依然として有効ではない。 後天性抵抗に続いて、NSCLCの全身進行は、EGFR変異陽性NSCLC患者の治療において重要な障害のままである。ここで、EGFRエキソン19における15塩基対欠損のEGFR活性化変異を有するNSCLC PC-9細胞から3つの独立したアファチニブ耐性細胞株を確立するための段階的な用量エスカレーション法を提示する。3つの独立したアファチニブ耐性細胞株を特徴付けるための方法を簡単に説明する。EGFR TKIに対する後天性抵抗機構は不均一である。したがって、EGFR-TKIに対する後天性耐性を持つ複数の細胞株を調べる必要があります。この段階的な用量エスカレーションアプローチを使用して、後天性抵抗を持つ細胞株を得るために10〜12ヶ月が必要です。新しい取得抵抗機構の発見は、より効果的で安全な治療戦略の開発に貢献します。
Introduction
5つのチロシンキナーゼ阻害剤、表皮成長因子受容体(EGFR)を標的とし、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、およびオシメルチニブを含む、EGFR変異陽性非小細胞肺の患者を治療するために現在利用可能であるがん (NSCLC)。過去10年間にわたり、このような患者のための治療法は、新しい潜在的なEGFR-TKIの発見と劇的な発展を遂げました。肺腺癌の患者の中で、EGFRの体細胞変異は、アジアの約50%および白人患者の15%で同定される。EGFRにおける最も一般的な変異は、EGFRエキソン21および15塩基対(bp)欠損におけるL858R点変異である。NSCLCを有するEGFR変異陽性患者において、EGFR-TKIは、以前の標準のプラチナ・ダブルト化学療法3と比較して、応答率および臨床転帰を改善する。
ゲフィチニブおよびエルロチニブは、最初に承認された低分子阻害剤であり、一般に第1世代EGFR TKIと呼ばれています。これらのEGFR TKIは、ATPと競合し、ATP結合部位4に可逆的に結合することにより、チロシンキナーゼ活性をブロックする。アファチニブは、EGFRのチロシンキナーゼドメインに不可逆的かつ共有的に結合する第2世代EGFR TKIであり、汎ヒトEGFRファミリー阻害剤5として特徴付ける。
NSCLC患者におけるこれらの治療法の劇的な利益にもかかわらず、獲得された抵抗は避けられない。第1および第2世代のEGFR TKIに対する最も一般的な耐性機構は、腫瘍試料6、7、8の50〜70%に存在するEGFRエキソン20におけるT790M変異の出現である。その他の抵抗機構には、バイパスシグナル(MET、IGF1R、およびHER2)、小細胞肺癌への変換、および前臨床および臨床的に9に起こる上皮間葉間膜遷移の誘導が含まれる。EGFR TKIに対する抵抗機構は不均一である。前臨床試験における新規耐性機構を同定することにより、耐性を克服する新規治療薬の開発が可能となる可能性がある。患者に対する臨床的利益を最大化する最適な配列療法は、抵抗機構および治療目標を考慮しなければならない。
それはすべての後続の実験の基礎であるので、右の親の細胞株を選択することが不可欠です。選択戦略は臨床的な関連性から始まります。化学療法と放射線ナイーブ細胞株を選択する必要があります。以前の化学療法および/または放射治療は、抵抗経路の変化および薬剤耐性マーカーの発現の変化を誘発し得る。本研究では、EGFRエキソン19で15bp欠損を担うPC-9細胞が、アファチニブに対する後天性耐性の確立に用いられる。この細胞株は、化学療法と放射線治療を受けていない日本のNSCLC患者に由来した。
アファチニブは日常的に経口投与されるので、連続的なインビトロ治療は、細胞がアファチニブの存在下で絶えず培養される場合には臨床的に関連するであろう。実験の様々なステップで使用される薬物の用量は、選択された親細胞株のために最適化されなければならない。細胞毒性アッセイは、薬物の薬物動態情報に匹敵するはずの適切な薬物範囲を決定するために使用することができる。
選択プロセス全体を通じて、細胞の母集団全体が単一のグループとして維持されます。クローン作成またはその他の分離方法は使用されません。細胞は、最初に薬物の低レベルに連続的に露出されます。続いて、細胞が薬物の存在下で増殖するように適応した後、薬物の用量は、薬物10、11の最終最適用量にゆっくりと増加する。あるいは、パルス薬物投与または変異発生は、薬剤治療12、13の前に行われる抵抗細胞の選択に使用することができる。残念ながら、薬剤耐性が発症しない症例は一般的に報告されていない。選択戦略は、臨床的に関連する抵抗を再構築するための癌患者の状態を模倣することを目的として開発されています。時には、薬剤耐性のメカニズムに関連する分子変化を同定するために、高い薬物濃度が使用される。このモデルは臨床的に関連性が低くなる。
ここでは、EGFRエキソン19における15bp欠損を持つPC-9細胞から3つの独立したアファチニブ耐性細胞株を確立する方法と、アファチニブ耐性細胞株の初期特性を確立する方法について説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、3つの独立したアファチニブ耐性細胞株を確立する方法を説明し、親のPC-9細胞と比較してこれらの細胞を特徴付けた。段階的な用量エスカレーション暴露により、親のPC-9細胞は10〜12ヶ月の期間にわたってアファチニブに対する耐性を獲得した。臨床的には、EGFR TKIに対する耐性機構は不均一であり、したがって、アファチニブによる初期処理後、PC-9細胞を3つの独立したp100皿に分?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
先進がん翻訳研究所のメンバーの皆さんの思いやりのあるコメントと編集に感謝します。この作品は、JSPS KAKENHI(助成番号:16K09590 to T.Y.)によってサポートされました。
Materials
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
Riferimenti
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