Etablering og karakterisering af tre Afatinib-resistente lunge adenokarcinom PC-9 cellelinjer udviklet med stigende doser Afatinib
Summary
En metode til at etablere afatinib-resistens cellelinjer fra lunge adenokarcinom PC-9 celler blev udviklet, og resistente celler blev karakteriseret. De resistente celler kan bruges til at undersøge epidermal vækstfaktor receptor tyrosinkinase hæmmer-resistensmekanismer, der gælder for patienter med ikke-småcellet lungekræft.
Abstract
Erhvervet resistens over for molekylære målhæmmere er et alvorligt problem i kræftbehandling. Lungekræft er fortsat den hyppigste årsag til kræft relateret død i de fleste lande. Opdagelsen af “oncogenic driver mutationer”, såsom epidermal vækstfaktor receptor (EGFR)-aktiverende mutationer, og efterfølgende udvikling af molekylære målrettede agenter af EGFR Tyrosinkinasehæmmere (tkis) (Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib og osimertinib) har i de seneste årtier dramatisk ændret lungekræft behandling. Men, disse lægemidler er stadig ikke effektiv hos patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) transporterer EGFR-aktiverende mutationer. Efter erhvervet resistens er den systemiske progression af NSCLC fortsat en væsentlig hindring for behandling af patienter med EGFR-mutation-positiv NSCLC. Her præsenterer vi en trinvis dosisoptrapning metode til etablering af tre uafhængige erhvervede afatinib-resistente cellelinjer fra NSCLC PC-9 celler husly EGFR-aktiverende mutationer af 15-base par sletninger i EGFR exon 19. Metoder til karakterisering af de tre uafhængige afatinib-resistens cellelinjer præsenteres kortvarigt. De erhvervede resistensmekanismer til EGFR TKIs er heterogene. Derfor skal flere cellelinjer med erhvervet resistens over for EGFR-TKIs undersøges. Ti til tolv måneder er forpligtet til at opnå cellelinjer med erhvervet resistens ved hjælp af denne trinvise dosisoptrapning tilgang. Opdagelsen af nye erhvervede resistensmekanismer vil bidrage til udviklingen af mere effektive og sikre terapeutiske strategier.
Introduction
Fem tyrosinkinasehæmmere, der er rettet mod epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), herunder Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib og osimertinib, er i øjeblikket tilgængelige til behandling af patienter med EGFR-mutation-positiv ikke-småcellet lunge kræft (NSCLC). I løbet af det seneste årti har terapier for sådanne patienter gennemgået en dramatisk udvikling med opdagelsen af nye potentielle EGFR-TKIs. Blandt patienter med lungeadenokarcinom er somatiske mutationer i EGFR identificeret hos ca. 50% af de asiatiske og 15% af de kaukasiske patienter1. De mest almindeligt forekommende mutationer i EGFR er en L858R point mutation i EGFR exon 21 og 15 base pair (BP) sletninger i EGFR exon 192. Hos EGFR-mutation-positive patienter med NSCLC forbedrer EGFR-TKIs responsraterne og de kliniske resultater sammenlignet med den tidligere platin-dobbelt-Doublet-kemoterapi3.
Gefitinib og erlotinib var de første godkendte små molekyle inhibitorer og omtales almindeligvis som første generations-EGFR-TKIs. Disse EGFR TKIs blokere tyrosinkinase aktivitet ved at konkurrere med ATP og reversibelt binding til ATP bindingssteder4. Afatinib er en anden generation af EGFR TKI, som uigenkaldeligt og kovalent binder sig til EGFR ‘s tyrosinkinase-domæne og er karakteriseret som en pan-menneskelig EGFR-familie hæmmer5.
På trods af den dramatiske fordel af disse terapier hos patienter med NSCLC, erhvervet resistens er uundgåelig. Den mest almindeligt modstands mekanisme mod første-og andengenerations EGFR tkis er fremkomsten af T790M-mutationen i EGFR exon 20, som er til stede i 50-70% af tumor prøverne6,7,8. Andre resistensmekanismer omfatter bypass-signaler (til at opfylde, IGF1R, og HER2), omdannelse til småcellet lungekræft, og induktion af epitel-til-mesenchymal overgang, som forekommer præklinisk og klinisk9. Resistensmekanismerne til EGFR TKIs er heterogene. Ved at identificere nye resistensmekanismer i prækliniske undersøgelser, det kan være muligt at udvikle nye Therapeutics at overvinde resistens. Optimale sekvens terapier, der maksimerer den kliniske fordel for patienter skal overveje resistensmekanismer og terapeutiske mål.
Det er bydende nødvendigt at vælge den rigtige forældre cellelinje, da det er grundlaget for alle de efterfølgende eksperimenter. Udvælgelses strategierne begynder med klinisk relevans; Det er nødvendigt at vælge en kemoterapi og stråling naive cellelinje. Tidligere kemoterapeutisk og/eller strålebehandling kan medføre ændring af resistens veje og ændringer i ekspression af resistensmarkører. I denne undersøgelse anvendes PC-9-celler, der transporterer 15 BP-sletninger i EGFR exon 19, til etablering af erhvervet resistens over for afatinib. Denne cellelinje blev afledt af en japansk NSCLC patient, der ikke fik tidligere kemoterapi og stråling.
Da afatinib administreres oralt på daglig basis, vil kontinuerlig in vitro-behandling, hvor cellerne konstant dyrkes i nærværelse af afatinib, være klinisk relevante. Den dosis af lægemidler, der anvendes i de forskellige trin af eksperimentet, skal optimeres for den valgte forældre cellelinje. En cytotoksicitet analyse kan anvendes til bestemmelse af et egnet stof område, som bør være sammenlignelig med de farmakokinetiske oplysninger af lægemidlet.
Under hele udvælgelsesprocessen opretholdes hele populationen af celler som en enkelt gruppe. kloning eller andre separations metoder anvendes ikke. Cellerne er først kontinuerligt udsat for et lavt niveau af lægemidlet. Efterfølgende, når cellerne tilpasse sig til at vokse i nærværelse af stoffet, dosis af lægemidlet er langsomt steget til den endelige optimale dosis af lægemidlet10,11. Alternativt kan en puls Drug-Administration eller mutagenese anvendes til udvælgelse af resistens celler, som også udføres før behandling med lægemidler 12,13. Desværre er tilfælde, hvor lægemiddelresistens ikke udvikler, generelt ikke indberettet. Udvælgelses strategierne er udviklet med det formål at forsøge at efterligne betingelserne for kræftpatienter til genopbygning af klinisk relevant resistens. Nogle gange, for at identificere molekylære ændringer i forbindelse med mekanismer af lægemiddelresistens, en høj stof koncentration anvendes. Denne model bliver mindre klinisk relevant.
Her beskriver vi en metode til at etablere tre uafhængige afatinib-resistente cellelinjer fra PC-9-celler, der harkedeligt 15 BP-sletninger i EGFR exon 19 samt den indledende karakterisering af de afatinib-resistente cellelinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrev vi en metode til etablering af tre uafhængige afatinib-resistente cellelinjer og karakteriserede disse celler i forhold til forældre-PC-9-celler. Ved trinvise dosiseskalerende eksponering erhvervede de forældre baserede PC-9-celler resistens over for afatinib i en periode på 10-12 måneder. Klinisk, resistensmekanismerne til EGFR TKIs er heterogene, og derfor, efter den indledende behandling med afatinib, PC-9 celler blev opdelt i tre uafhængige P100 retter og eksponeret yderligere for afatinib. I først…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmet af Advanced Cancer translationelle Research Institute for deres tankevækkende kommentarer og Editage for deres hjælp med engelsk sprog redigering. Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI (tilskudsnummer: 16K09590 til T.Y.).
Materials
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
Riferimenti
- Chan, B. A., Hughes, B. G. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future. Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).
- Mitsudomi, T., Yatabe, Y. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).
- Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy. International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).
- Marshall, J. Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors. Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).
- Hirsh, V. Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer. Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).
- Arcila, M. E., et al. Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay. Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Yang, J. C., et al. Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component. Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).
- Chong, C. R., Janne, P. A. The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer. Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).
- Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A. Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).
- Yamaoka, T., et al. Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation. Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).
- Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines. Ricerca sul cancro. 63 (18), 5909-5916 (2003).
- Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes. British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).
- Murakami, H., et al. Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4). Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).
- Nukaga, S., et al. Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors. Ricerca sul cancro. 77 (8), 2078-2089 (2017).
- Nakatani, K., et al. EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR. Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).
- Piotrowska, Z., et al. Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor. Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).
- Ortiz-Cuaran, S., et al. Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors. Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).
- Kobayashi, Y., et al. Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer. Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).
- Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment. Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).
