Etablering och karakterisering av tre afatinib-resistenta lung adenocarcinom PC-9 cellinjer som utvecklats med ökande doser av afatinib
Summary
En metod för att fastställa afatinib-resistens cellinjer från lung adenocarcinom PC-9 celler utvecklades, och resistenta celler karakteriserades. De resistenta cellerna kan användas för att undersöka epidermal tillväxtfaktorreceptor tyrosinkinashämmare-resistensmekanismer, gäller för patienter med icke-småcellig lungcancer.
Abstract
Förvärvad resistens mot molekylära mål hämmare är ett allvarligt problem i cancerbehandling. Lung cancer är fortfarande den vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i de flesta länder. Upptäckten av “onkogen driver mutationer,” såsom epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR)-aktiverande mutationer, och efterföljande utveckling av molekylära riktade medel av EGFR tyrosinkinashämmare (tkis) (gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib och osimertinib) har dramatiskt förändrat lungcancer behandlingen under de senaste decennierna. Emellertid, dessa läkemedel är fortfarande inte effektiva hos patienter med icke-småcellig lungcancer (NSCLC) redovisade EGFR-aktiverande mutationer. Efter förvärvad resistens är den systemiska progressionen av NSCLC fortfarande ett betydande hinder vid behandling av patienter med EGFR-mutationspositiv NSCLC. Här presenterar vi en stegvis dos upptrappnings metod för att etablera tre oberoende förvärvade afatinib-resistenta cellinjer från NSCLC PC-9-celler som hartråkigt EGFR-aktiverande mutationer av 15-bas par borttagningar i EGFR exon 19. Metoder för att karakterisera de tre oberoende cellinjer med afatinib-resistens presenteras kortfattat. De förvärvade Resistensmekanismerna till EGFR TKIs är heterogena. Därför måste flera cellinjer med förvärvad resistens mot EGFR-TKIs undersökas. Tio till tolv månader krävs för att få cellinjer med förvärvad resistens med hjälp av denna stegvis dosupptrappning metod. Upptäckten av nya mekanismer för förvärvad resistens kommer att bidra till att utveckla effektivare och säkrare terapeutiska strategier.
Introduction
Fem tyrosinkinashämmare, riktade mot epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR), inklusive gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib och osimertinib är för närvarande tillgängliga för behandling av patienter med EGFR-mutationspositiva icke-småcellig lung cancer (NSCLC). Under det senaste decenniet har terapier för sådana patienter genomgått en dramatisk utveckling med upptäckten av nya potentiella EGFR-TKIs. Bland patienter med lungadenocarcinom, identifieras somatiska mutationer i EGFR hos cirka 50% av Asiaten och 15% av kaukasiska patienter1. De vanligaste mutationer i EGFR är en L858R punktmutation i EGFR exon 21 och 15 bas par (BP) borttagningar i EGFR exon 192. Hos EGFR-mutationspositiva patienter med NSCLC förbättrar EGFR-TKIs responsfrekvensen och de kliniska resultaten jämfört med den tidigare standarden på platina-Doublet kemoterapi3.
Gefitinib och erlotinib var de första godkända småmolekylära hämmare och kallas i allmänhet för första generationens EGFR TKIs. Dessa EGFR TKIs blockerar tyrosinkinas aktivitet genom att konkurrera med ATP och reversibelt bindning till ATP bindningsställen4. Afatinib är en andra generationens EGFR TKI som oåterkalleligt och kovalent binder till tyrosinkinasdomänen av EGFR och karaktäriseras som en pan-Human EGFR-familjehämmare5.
Trots den dramatiska nyttan av dessa terapier hos patienter med NSCLC, förvärvad resistens är oundviklig. Den vanligaste resistensmekanismen mot första och andra generationens EGFR-tkis är uppkomsten av T790M-mutationen i EGFR exon 20, som finns i 50-70% av tumörproverna6,7,8. Andra resistensmekanismer inkluderar bypass-signaler (till MET, IGF1R, och HER2), omvandling till småcellig lungcancer, och induktion av epitelial till mesenkymala övergång, som inträffar prekliniskt och kliniskt9. Resistensmekanismerna till EGFR TKIs är heterogena. Genom att identifiera nya resistensmekanismer i prekliniska studier kan det vara möjligt att utveckla nya Therapeutics för att övervinna resistens. Optimala sekvens terapier som maximerar den kliniska nyttan för patienter måste överväga resistensmekanismer och terapeutiska mål.
Det är absolut nödvändigt att välja rätt föräldra cell linje, eftersom det är grunden för alla efterföljande experiment. Urvals strategierna inleds med klinisk relevans; Det är nödvändigt att välja en kemoterapi och strålning naiva cellinjer. Tidigare kemoterapeutiska och/eller strålningsbehandling kan inducera förändringen av resistens vägar och förändringar av uttrycket av läkemedelsresistens markörer. I denna studie, PC-9 celler, transporterar 15 BP borttagningar i EGFR exon 19, är anställda för etablering av förvärvad resistens mot afatinib. Denna cell linje härstammar från en japansk NSCLC patient, som inte fick tidigare kemoterapi och strålning.
Eftersom afatinib administreras oralt på daglig basis, kontinuerlig in vitro-behandling, där cellerna odlas ständigt i närvaro av afatinib skulle vara kliniskt relevant. Dosen av läkemedel som används i de olika stegen i experimentet måste optimeras för den valda föräldra cellen. En cytotoxicitetstest kan användas för att bestämma ett lämpligt läkemedels område, som bör vara jämförbar med den farmakokinetiska informationen av drogen.
Hela urvalsprocessen bibehålls hela populationen av celler som en enda grupp; kloning eller andra separationsmetoder används inte. Cellerna är först kontinuerligt utsätts för en låg nivå av drogen. Därefter, efter att cellerna anpassar sig för att växa i närvaro av drogen, dosen av drogen ökas långsamt till den slutliga optimala dosen av drogen10,11. Alternativt kan en puls läkemedelsadministrering eller mutagenes användas för att välja motstånds celler, som också utförs före läkemedelsbehandling 12,13. Tyvärr, fall där läkemedelsresistens inte utvecklas är i allmänhet inte rapporteras. Urvals strategierna utvecklas i syfte att försöka efterlikna cancer patienternas tillstånd för att återuppbygga kliniskt relevant resistens. Ibland, för att identifiera molekylära förändringar i samband med mekanismer för läkemedelsresistens, en hög läkemedelskoncentration används. Denna modell blir mindre kliniskt relevant.
Här beskriver vi en metod för att etablera tre oberoende afatinib-resistenta cellinjer från PC-9-celler som hartråkigt 15 BP-borttagningar i EGFR exon 19 samt den initiala karakteriseringen av afatinib-resistenta cellinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrev vi en metod för att etablera tre oberoende afatinib-resistenta cellinjer och karakteriserade dessa celler i jämförelse med föräldrarnas PC-9-celler. Genom stegvis dos öknings exponering förvärvade föräldra-PC-9-cellerna resistens mot afatinib under en period av 10-12 månader. Kliniskt är Resistensmekanismerna till EGFR TKIs heterogena, och därför, efter den initiala behandlingen med afatinib, var PC-9-celler indelade i tre oberoende P100-rätter och exponerade ytterligare för afatinib. Inledni…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar den medlem av Advanced cancer translationella forskningsinstitut för deras tankeväckande kommentarer och Editage för deras hjälp med engelsk språk redigering. Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI (Grant Number: 16K09590 till T.Y.).
Materials
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
Riferimenti
- Chan, B. A., Hughes, B. G. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future. Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).
- Mitsudomi, T., Yatabe, Y. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).
- Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy. International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).
- Marshall, J. Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors. Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).
- Hirsh, V. Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer. Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).
- Arcila, M. E., et al. Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay. Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Yang, J. C., et al. Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component. Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).
- Chong, C. R., Janne, P. A. The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer. Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).
- Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A. Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).
- Yamaoka, T., et al. Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation. Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).
- Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines. Ricerca sul cancro. 63 (18), 5909-5916 (2003).
- Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes. British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).
- Murakami, H., et al. Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4). Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).
- Nukaga, S., et al. Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors. Ricerca sul cancro. 77 (8), 2078-2089 (2017).
- Nakatani, K., et al. EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR. Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).
- Piotrowska, Z., et al. Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor. Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).
- Ortiz-Cuaran, S., et al. Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors. Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).
- Kobayashi, Y., et al. Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer. Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).
- Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment. Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).
