Een methode voor het vaststellen van afatinib-resistentie cellijnen van Long adenocarcinoom PC-9 cellen werd ontwikkeld, en resistente cellen werden gekarakteriseerd. De resistente cellen kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van epidermale groeifactor receptor tyrosine kinase remmer-resistentiemechanismen, toepasbaar voor patiënten met niet-kleincellige longkanker.
Verworven resistentie tegen moleculaire doelwit remmers is een ernstig probleem in de kankertherapie. Longkanker blijft de belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde dood in de meeste landen. De ontdekking van “oncogene bestuurders mutaties,” zoals epidermale groeifactor receptor (EGFR)-activerende mutaties, en latere ontwikkeling van moleculaire doelstoffen van EGFR-tyrosine kinase remmers (tkis) (gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib en osimertinib) hebben de behandeling van longkanker in de afgelopen decennia drastisch veranderd. Deze geneesmiddelen zijn echter nog steeds niet effectief bij patiënten met niet-kleincellige longkanker (NSCLC) die EGFR-activerende mutaties uitvoeren. Na verworven resistentie blijft de systemische progressie van NSCLC een significant obstakel bij de behandeling van patiënten met EGFR-mutatie-positieve NSCLC. Hier presenteren we een stapsgewijze dosisescalatie methode voor het instellen van drie onafhankelijke verworven afatinib-resistente cellijnen van NSCLC PC-9-cellen die harkotteren EGFR-activerende mutaties van 15-basepaar verwijderingen in EGFR Exon 19. Methoden voor het karakteriseren van de drie onafhankelijke afatinib-resistentie cellijnen worden kort gepresenteerd. De verworven resistentiemechanismen voor EGFR-TKIs zijn heterogeen. Daarom moeten meerdere cellijnen met verworven resistentie tegen EGFR-TKIs worden onderzocht. Tien tot twaalf maanden zijn nodig om cellijnen met verworven resistentie te verkrijgen met behulp van deze stapsgewijze dosisescalatie aanpak. De ontdekking van nieuwe verworven resistentiemechanismen zal bijdragen aan de ontwikkeling van effectievere en veilige therapeutische strategieën.
Vijf tyrosinekinaseremmers, gericht op epidermale groeifactor receptor (EGFR), waaronder gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib en osimertinib, zijn momenteel beschikbaar voor de behandeling van patiënten met EGFR-mutatie-positieve niet-kleincellige Long kanker (NSCLC). De afgelopen tien jaar hebben therapieën voor dergelijke patiënten een dramatische ontwikkeling ondergaan met de ontdekking van nieuwe mogelijke EGFR-TKIs. Bij patiënten met Long adenocarcinoom worden somatische mutaties in EGFR geïdentificeerd bij ongeveer 50% van de Aziatische en 15% van de blanke patiënten1. De meest voorkomende mutaties in EGFR zijn een L858R puntmutatie in EGFR Exon 21 en 15 base pair (BP) verwijderingen in EGFR Exon 192. Bij EGFR-mutatie-positieve patiënten met NSCLC verbeteren EGFR-TKIs de responspercentages en klinische uitkomsten in vergelijking met de vorige standaard van Platinum Doublet chemotherapie3.
Gefitinib en erlotinib waren de eerste goedgekeurde kleine molecuul remmers en worden in het algemeen aangeduid als eerste generatie EGFR-Tki’s. Deze EGFR TKIs blok tyrosine kinase activiteit door te concurreren met ATP en omkeerbaar binding aan ATP binding sites4. Afatinib is een EGFR TKI van de tweede generatie die onherroepelijk en covalent bindt aan het tyrosine kinase domein van EGFR en wordt gekarakteriseerd als een pan-humane EGFR-familie remmer5.
Ondanks het dramatisch voordeel van deze therapieën bij patiënten met NSCLC, is verworven resistentie onvermijdelijk. Het meest voorkomende Resistentiemechanisme tegen de eerste en tweede generatie EGFR-tkis is de opkomst van de T790M-mutatie in EGFR Exon 20, die aanwezig is in 50-70% van de tumormonsters6,7,8. Andere weerstand mechanismen omvatten bypass-signalen (om te voldoen aan, IGF1R, en HER2), transformatie naar kleincellige longkanker, en inductie van de epitheliale-naar-mesenchymale overgang, die pre-klinisch en klinisch9optreden. De resistentiemechanismen voor EGFR-TKIs zijn heterogeen. Door het identificeren van nieuwe resistentiemechanismen in preklinische studies, kan het mogelijk zijn om nieuwe therapieën te ontwikkelen om resistentie te overwinnen. Optimale sequentie therapieën die het klinisch voordeel voor patiënten maximaliseren, moeten rekening houden met de resistentiemechanismen en het therapeutische doel.
Het is noodzakelijk om de juiste ouderlijke cellijn te kiezen, omdat het de basis is van alle daaropvolgende experimenten. De selectie strategieën beginnen met klinische relevantie; het is noodzakelijk om te kiezen voor een chemotherapie en straling naïeve cellijn. Eerdere chemotherapeutische en/of radiatieve behandeling kan de verandering van resistentie trajecten en veranderingen van de expressie van resistentie markers voor geneesmiddelen induceren. In deze studie worden PC-9-cellen, die 15 BP-verwijderingen in EGFR Exon 19 dragen, gebruikt voor de vaststelling van verworven resistentie tegen afatinib. Deze cellijn werd afgeleid van een Japanse NSCLC-patiënt, die geen eerdere chemotherapie en straling kreeg.
Omdat afatinib dagelijks oraal wordt toegediend, is een continue in vitro behandeling, waarbij de cellen voortdurend in aanwezigheid van afatinib worden gekweekt, klinisch relevant. De dosis geneesmiddelen die in de verschillende stappen van het experiment worden gebruikt, moet worden geoptimaliseerd voor de geselecteerde bovenliggende cellijn. Een cytotoxiciteits test kan worden gebruikt voor het bepalen van een geschikt geneesmiddelen bereik, dat vergelijkbaar moet zijn met de farmacokinetische informatie van het geneesmiddel.
Gedurende het hele selectieproces wordt de hele populatie cellen gehandhaafd als één groep; klonen of andere scheidingsmethoden worden niet gebruikt. De cellen worden eerst voortdurend blootgesteld aan een laag niveau van het geneesmiddel. Vervolgens, nadat de cellen zich aanpassen om te groeien in de aanwezigheid van het medicijn, wordt de dosis van het medicijn langzaam verhoogd tot de uiteindelijke optimale dosis van het geneesmiddel10,11. Als alternatief kan een Pulse Drug-Administration of mutagenese worden gebruikt voor het selecteren van resistentie cellen, die ook worden uitgevoerd voorafgaand aan medicamenteuze behandeling 12,13. Helaas worden gevallen waarin de resistentie tegen geneesmiddelen niet wordt ontwikkeld, meestal niet gerapporteerd. De selectie strategieën zijn ontwikkeld met als doel de voorwaarden van kankerpatiënten na te bootsen voor de wederopbouw van klinisch relevante resistentie. Soms, om moleculaire veranderingen in verband met mechanismen van de resistentie van de drug te identificeren, een hoge concentratie van het geneesmiddel wordt gebruikt. Dit model wordt minder klinisch relevant.
Hier beschrijven we een methode voor het instellen van drie onafhankelijke afatinib-resistente cellijnen van PC-9-cellen die 15 BP-verwijderingen in EGFR Exon 19 en de initiële karakterisering van de afatinib-resistente cellijnen verharten.
Hier hebben we een methode beschreven voor het instellen van drie onafhankelijke afatinib-resistente cellijnen en deze cellen gekarakteriseerd door vergelijking met ouder PC-9-cellen. Door stapsgewijze blootstelling aan de dosisescalatie hebben de ouder PC-9-cellen gedurende een periode van 10-12 maanden resistentie tegen afatinib verworven. Klinisch zijn de resistentiemechanismen voor EGFR-Tki’s heterogeen, en daarom werden PC-9-cellen na de eerste behandeling met afatinib verdeeld in drie onafhankelijke P100 gerechten …
The authors have nothing to disclose.
We danken het lid van het Advanced Cancer Translational Research Institute voor hun doordachte commentaren en Editage voor hun hulp bij het bewerken van Engelse taal. Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI (subsidie nummer: 16K09590 tot T.Y.).
afatinib | Selleck | S1011 | |
anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
cell-culture treated 10cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
DMSO | Wako | 043-07216 | |
ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
FBS | gibco | 26140-079 | |
GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
TBST powder | sigma | T9039 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
96 well microplate | Thermo | 130188 |