Imaging integrine spanning en cellulaire kracht bij Submicron resolutie met de Sensor van een integratieve spanning
Summary
Integrine spanning speelt belangrijke rol in verschillende functies van de cel. Met de sensor van een integratieve spanning, is integrine spanning gekalibreerd met picoNewton (pN) gevoeligheid en beeld bij submicron resolutie.
Abstract
Moleculaire spanning langs integrine-ligand obligaties is het fundamentele mechanische signaal in het integrine-traject dat belangrijke rol in de vele functies van de cel en gedrag speelt. Als u wilt kalibreren en afbeelding van integrine spanning met hoge kracht gevoeligheid en ruimtelijke resolutie, ontwikkelden we een integratieve spanning sensor (ITS), een fluorescerende spanning op basis van DNA-sensor. Het ITS is geactiveerd om lichten als een moleculaire spanning, ondersteunen kracht dus omzetten in fluorescerende signaal op moleculair niveau. De drempel van de spanning voor ITS activering is afstembare in de range van 10 – 60 pN die goed dekt het dynamisch bereik van integrine spanning in cellen. Op een substraat met een ITS geënt, is de spanning van integrine Adherente cellen gevisualiseerd door fluorescentie en beeld bij submicron resolutie. Het ITS is ook compatibel met structurele beeldvorming van de cel zowel vaste cellen in levende cellen. Het ITS is met succes toegepast op de studie van bloedplaatjes contractie en cel migratie. Deze paper detailleert de procedure voor de synthese en de toepassing van ITS in de studie van integrine overdraagbare cellulaire kracht.
Introduction
Cellen, is afhankelijk van integrins houden en uitoefenen van cellulaire krachten aan de extracellulaire matrix. Integrine-gemedieerde cel adhesie en kracht overdracht zijn cruciaal voor cel verspreiding van1,2, migratie3,4en6,7van de5,van de overleving. Op de lange termijn beïnvloedt integrine biomechanische signalering ook cel proliferatie8,9,10 en differentiatie11,12. Onderzoekers hebben ontwikkeld verschillende methoden om te meten en kaart integrine overdraagbare mobiele troepen op het raakvlak van cel-matrix. Deze methoden zijn gebaseerd op elastische substraat13, matrix van micropost14, of atomic force microscopie (AFM)15,16. Elastische onderlaag en micropost methoden, is afhankelijk van de vervorming van substraten te melden van de cellulaire stress en hebben beperkingen op het gebied van de ruimtelijke resolutie en kracht van de gevoeligheid. AFM heeft hoge kracht gevoeligheid, maar het niet wordt gedetecteerd door kracht op meerdere plekken tegelijk, waardoor het moeilijk om toe te wijzen cellulaire kracht overgebracht door integrins.
In de afgelopen jaren werden verschillende technieken ontwikkeld om te bestuderen van cellulaire kracht op moleculair niveau. Een verzameling van moleculaire spanning sensoren gebaseerd op polyethyleenglycol17,18, spider silk peptide19en DNA20,21,22,23 werden ontwikkeld om Visualiseer en controleren van spanning overgebracht door moleculaire proteïnen. Onder deze technieken, werd DNA aangenomen als het materiaal van de synthese in de spanning meten ketting (TGT), een rupturable linker die de bovengrens van integrine spanningen in levende cellen22,24 moduleert. Later, DNA- en fluorescentie resonantie overdracht techniek werden samengevoegd tot haarspeld DNA gebaseerde fluorescerende spanning sensoren eerst door Chen’s groep23 en Salaita de groep20. De sensor van de DNA-gebaseerde spanning haarspeld integrine spanning in real-time rapporten en is met succes toegepast op de studie van een reeks van cellulaire functies21. Daarna gecombineerd Wang’s lab een TGT met het fluorophore-quencher-paar verslag integrine spanning. Deze sensor heet een ITS25,26. Het ITS is gebaseerd op double-stranded DNA (dsDNA) en heeft een bredere dynamische waaier (pN 10-60) voor integrine spanning kalibratie. In tegenstelling tot haarspeld DNA gebaseerde sensoren, ITS rapporteert niet in real-time cellulaire geldende maar registreert alle historische integrine gebeurtenissen als de voetafdruk van cellulaire geweld; Dit signaal accumulatieproces verbetert de gevoeligheid voor cellulaire force imaging, waardoor het haalbaar afbeelding cellulaire kracht zelfs met een low-end fluorescentie Microscoop. De synthese van ITS is relatief gemakkelijker als het is gemaakt door kwekers twee single-stranded Ani (ssDNA).
Het ITS is een 18-base-gepaarde dsDNA geconjugeerd met biotine, een fluorophore, een quencher (Black Hole Quencher 2 [BHQ2])27en een cyclische arginylglycylaspartic zuur (RGD) peptide28 als een integrine peptide ligand (Figuur 1). De onderste lijn is geconjugeerd met de fluorophore (Cy3 wordt gebruikt in dit manuscript, terwijl andere kleurstoffen, zoals Cy5 of Alexa serie, ook is bewezen haalbaar in ons lab) en de Biotine tag, waarmee de ITS is geïmmobiliseerd op een substraat door Biotine-avidin bond. Het bovenste deel is geconjugeerd met de RGD-peptide en de Quencher van de Black Hole, die Cy3 met ongeveer 98% blussen efficiëntie26,27 lest. Met het protocol gepresenteerd in deze paper, is de dichtheid van de coating van de ITS op een substraat rond 1100/µm2. Dit is de dichtheid die we eerder gekalibreerd voor 18 bp biotinyleerd dsDNA bekleed op het substraat neutrAvidin-matiemaatschappij volgens hetzelfde protocol29coating. Wanneer cellen zich aan het substraat bedekt met de ITS houden, integrine bindt de ITS via RGD en spanning aan de ITS verzendt. Het ITS is een specifieke spanning tolerantie (Ttol) die is gedefinieerd als de spanning drempel die mechanisch de dsDNA van ITS binnen 2 s22 scheidt. DE breuk door integrine spanning leidt tot de scheiding van de quencher van de kleurstof die vervolgens fluorescentie uitzendt. Dientengevolge, de onzichtbare integrine spanning wordt geconverteerd naar een fluorescentie-signaal en de cellulaire kracht kan worden toegewezen door fluorescentie imaging.
Om aan te tonen van de toepassing van ITS, gebruiken we vis keratocyte hier, een model van de gebruikte cel voor cel migratie studie30,31,32, CHO-K1 cel, een veelgebruikte nonmotile cellijn en NIH 3T3 fibroblast. Coimaging van integrine spanning en cel structuren wordt ook uitgevoerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het ITS is een zeer toegankelijke maar toch krachtige techniek voor mobiele dwingen toewijzing in termen van zowel de synthese en de toepassing. Met alle materialen klaar, kan de ITS gesynthetiseerd worden binnen 1 dag. Tijdens experimenten, zijn slechts drie stappen van de oppervlaktelaag nodig voorafgaand aan cel beplating. Onlangs, we verder vereenvoudigd de coating procedure naar een stap door de ITS rechtstreeks te koppelen aan bovien serumalbumine, waardoor directe fysieke adsorptie van ITS glas of polystyreen oppe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het opstarten Fonds verstrekt door Iowa State University en door het National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).
Materials
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
References
- Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
- Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
- Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
- Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
- Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
- Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
- Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
- Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
- Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
- Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
- Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
- Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).
- Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
- Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
- Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
- Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
- Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
- Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
- Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
- Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
- Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
- Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
- Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
- Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
- Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
- Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
- Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
- Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
- Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
- Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
- Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
- Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
- de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences – Series IV – Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
- Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).
