Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Integrin gerginlik ve hücresel kuvvet bütünleştirici gerilim sensör ile Mikronaltı çözünürlükte görüntüleme

Published: April 25, 2019 doi: 10.3791/59476
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Physics and Astronomy, Iowa State University, 2Department of Physics and Astronomy, Molecular, Cellular, and Developmental Biology Interdepartmental Program, Iowa State University

Summary

Integrin gerginlik çeşitli hücre işlevlerinde önemli rol oynar. Bir bütünleştirici gerilim sensör ile integrin gerginlik picoNewton (pN) hassasiyeti ile kalibre edilmiş ve Mikronaltı çözünürlükte görüntüsü.

Abstract

Moleküler gerilim integrin-ligand bağları ile bulaşan birçok hücre fonksiyonları ve davranışları önemli rol oynayan integrin yolu temel mekanik sinyal olduğunu. Kalibre ve integrin gerilim yüksek kuvvet duyarlılık ve Uzaysal çözünürlük ile görüntü için geliştirdiğimiz bir bütünleştirici gerilim sensör (ITS), bir DNA tabanlı floresan gerilim sensör. Its moleküler gerilim sürdürülmesi Eğer bulabilsem böylece kuvvet moleküler seviyede floresan sinyal dönüştürme etkinleştirilir. Its harekete geçirmek için gerilim eşik tunable iyi kameranın dinamik alanı hücreleri integrin gerginlik kapakları pN 10-60 aralığında. Bir Its ile aşılı bir yüzey üzerinde integrin gerginlik yapışık hücreleri floresan tarafından görüntülenir ve Mikronaltı çözünürlükte görüntülü. Its da canlı hücreleri ve sabit hücreleri hücre yapısal görüntüleme ile uyumludur. Its çalışma trombosit daralma ve hücre geçiş başarıyla uygulandı. Bu kağıt için prosedür sentezi ve hücresel kuvvet integrin ile bulaşan insan Its uygulama ayrıntıları.

Introduction

Hücreleri integrinler uygun ve hücre dışı matriks hücresel kuvvetlerinin uygulamak için güveniyor. Integrin aracılı hücre adezyon ve güç iletim1,2, geçiş3,4ve hayatta kalma5,6,7yayılan hücre için çok önemlidir. Uzun vadede integrin biyomekanik sinyal Hücre proliferasyonu8,9,10 ve farklılaşma11,12de etkiler. Araştırmacılar ölçmek için çeşitli yöntemler geliştirdik ve harita integrin ile bulaşan cep cep-matris arayüzü zorlar. Bu yöntemler elastik terkedilemeyen13tarihinde dayanmaktadır, dizi micropost14, ya da Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM)15,16. Elastik terkedilemeyen ve micropost yöntemleri hücresel stres raporu ve Uzaysal çözünürlük açısından kısıtlamaları ve duyarlılık zorlamak için yüzeylerde deformasyon üzerinde güveniyor. AFM yüksek kuvvet duyarlılığa sahiptir ama aynı anda birden çok noktalarda kuvvet algılayamaz, hücresel kuvvet eşlemek üzere integrinler tarafından iletilen.

Son yıllarda, moleküler seviyede hücresel kuvvet çalışma için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Polietilen glikol17,18, spider ipek peptid19ve DNA20,21,22,23 dayalı moleküler gerilim sensörler topluluğu için geliştirilmiştir görselleştirmek ve gerginlik moleküler proteinler tarafından iletilen izlemek. Bu teknikler arasında gerginlik sentez malzeme ölçmek gibi urgan (TGT), canlı hücreleri22,24integrin gerginlik üst sınırı gelen bir rupturable bağlayıcı DNA ilk kabul edilmiştir. Daha sonra DNA ve floresan rezonans transfer tekniği kombine saç tokası floresan gerginlik DNA tabanlı sensörler oluşturmak için ilk Chen'in grup23 ve Salaita'nın grup20tarafından. Saç tokası DNA tabanlı gerilim sensör integrin gerginlik gerçek zamanlı raporlar ve hücresel işlevler21bir dizi çalışma için başarıyla uygulandı. Daha sonra Wang'ın laboratuvar rapor integrin gerginlik fluorophore-içki çiftine TGT birlikte. Bu sensör bir Its25,26olarak adlandırılır. Its çift iplikçikli DNA (dsDNA) dayanır ve integrin gerginlik kalibrasyon için daha geniş dinamik alan (10-60 pN) vardır. Saç tokası sensörleri, DNA tabanlı aksine Its hücresel kuvvet içinde gerçek-zaman rapor ama hücresel kuvvet ayak izi tüm tarihi integrin olayları kaydeder; Bu sinyal birikimi işlem Imaging, uygun görüntü hücresel gücüne bile düşük-uç floresan mikroskop ile yapım o hücresel kuvvet için duyarlılık geliştirir. Its sentezi iki tek iplikçikli DNA'lar (ssDNA) hybridizing tarafından oluşturulduğu gibi nispeten daha kolaydır.

Its integrin peptid ligand (şekil 1) biotin, bir fluorophore, bir içki (kara delik içki 2 [BHQ2])27ve bir döngüsel arginylglycylaspartic asit (RGD) peptid28 ile Birleşik bir 18 Bankası eşleştirilen dsDNA var. Alt strand fluorophore ile Birleşik (Cy3 Cy5 veya Alexa serisi gibi diğer boyalar ise bu el yazması kullanılır, aynı zamanda bizim laboratuarımızda uygun kanıtlanmıştır) ve hangi ile Its immobilize bir substrat biotin avidin bağ ile biotin etiketi. Üst strand RGD peptid ve Cy3 yaklaşık % 98'i su verme verimliliği26,27ile quenches kara delik içki ile Birleşik. Bu raporda sunulan ile bir yüzey üzerinde Its kaplama yoğunluğu 1100/µm2iletişim kuralıdır. Bu daha önce aynı protokolü29kaplama takip ederek neutrAvidin functionalized substrat kaplı 18 bp biotinylated dsDNA için kalibre yoğunluğudur. Its ile kaplı yüzey hücreleri uymak, integrin RGD aracılığıyla Its bağlar ve gerginlik için Its iletir. Its Its 2 s22içinde dsDNA mekanik olarak ayıran gerilim eşik olarak tanımlanan belirli gerilim toleransı (Ttol) vardır. ONUN rüptürü integrin gerilim tarafından içki ayrılması daha sonra Floresans yayar boya yol açar. Sonuç olarak, görünmez integrin gerginlik bir floresan sinyale dönüştürülür ve hücresel kuvvet Floresans görüntüleme tarafından eşleştirilebilir.

Its uygulama göstermek için balık keratocyte burada, hücre geçiş çalışma30,31,32için yaygın olarak kullanılan hücre modeli, CHO-K1 cep, yaygın olarak kullanılan nonmotile hücre kültürünü ve NIH 3T3 fibroblast kullanın. Coimaging integrin gerginlik ve hücre yapıları da yapılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC, 8-16-8333-ben) Iowa State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. bütünleştirici gerilim sensör sentezi

  1. SsDNAs ( Tablo reçetesigörmek) sipariş ve özelleştirin.
    Not: Aşağıdaki gibi ssDNA dizileri vardır. Üst strand /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2/olduğunu. Alt lifler aşağıdaki gibidir.
    12 pN Its: / 5Cy3/GGC MOLDOVA'da CTG CGT SKK CCC /3Bio/
    23 pN Its: / 5Cy3/GGC MOLDOVA'da CTG CGT CC /iBiodT/ CCC
    33 pN Its: / 5Cy3/GGC MOLDOVA'da CTG CG/iBiodT/SKK CCC
    43 pN Its: / 5Cy3/GGC MOLDOVA'da C/iBiodT/G CGT SKK CCC
    54 pN Its: /5Biosg / / iCy3/GGC MOLDOVA'da CTG CGT SKK CCC
    Burada, /5ThioMC6-D / vasıl belgili tanımlık son 5' thiol değiştirici C6 S-S (disülfür) temsil eder. /3BHQ_2/ bir kara delik içki 2 3' ucunda temsil eder. / 3Bio /, / 5Biosg / ve /iBiodT/ biotinylation sonunda 3', 5' uç ve timin iç DNA üzerinde sırasıyla vardır. /iCy3/ ssDNA iç omurgası eklenen bir Cy3 temsil eder. Bu kodları burada kullanılan belirli ticari tedarikçi tarafından kullanılır ve diğer DNA şirketlerde farklı olabilir.
  2. Eşlenik RGD peptid SH-ssDNA-içki için.
    Not: kullanılan reaktifler fosfat tamponlu tuz (PBS), sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) Siklokekzan-1-karboksilat (sulfo-SMCC), RGD peptid ve tris - vardır (2-carboxyethyl) fosfamin hidroklorür, olarak da bilinen TCEP HCl.
    1. TCEP çözüm kullanarak üst iplikçik DNA thiol değiştirici deprotect.
      Not: ticari bir kaynaktan sipariş Thiol-modified DNA'lar RGD-DNA konjugasyon önce azaltılmış bir disülfür bağ tarafından korunan kükürt atomlara ile okside formunda sevk edilir. TCEP thiol deprotection için kullanılan bir kokusuz giderme reaktifi var.
      1. TCEP-HCl 14.3 mg 300 µL su içinde çözülür. ~7.2–7.4 TCEP çözüm 1 M NaOH solüsyonu (yaklaşık 150 µL), pH pH test kağıtları kullanarak ayarlayın. Son hacmi 0.5 mL saf su ekleyin. Son TCEP konsantrasyon 100 mM olduğunu.
        Not: Bu TCEP çözüm DNA thiol deprotection için her zaman taze yapmak için tavsiye edilir. TCEP çözüm uzun çorap kaçının.
      2. 0, 5 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözüm 100 µL ve su 400 µL TCEP ekleyin.
      3. TCEP + EDTA çözüm 10 µL 1 mM thiol-DNA-BHQ2 PBS içinde 20 µL ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika tepki çözüm ver.
        Not: 5' thiol değiştirici C6 S-S konjügasyon, bu ssDNA disülfit bağı TCEP, thiol grubu sonraki adımda tepki ile maleimide için hazır bırakarak tarafından i ciddi. TCEP aşağıdaki thiol maleimide reaksiyon ile müdahale değil; Bu nedenle, bu aşamadan sonra TCEP passivate için gerekli değildir.
    2. Sulfo-SMCC ile eşlenik RGD-NH2 .
      1. RGD-NH2 11 mM RGD-NH2elde etmek için PBS 100 µL ' 5 mg geçiyoruz.
      2. Sulfo-SMCC (tedarikçi tarafından puttyi) 2 mg ile tüp 200 µL saf su ekleyin. Sulfo-SMCC katı bir pipet ucu ile şut ve şiddetle SMCC suda eriyen kolaylaştırmak için aynı anda pipet. Sulfo-SMCC konsantrasyonu 23 mM olacaktır.
        Not: sulfo-SMCC içinde NHS ester hidroliz tabidir ve olarak birkaç dakikalık bir ömre sahiptir çünkü eriterek bu adımı NHS ester hidroliz nedeniyle aşırı kaybı olmaması için 1 dakika içinde tamamlanmalıdır. Onun çözünürlük PBS veya diğer arabellekleri zavallı olduğu için sulfo-SMCC çözülmeye saf su kullanın.
      3. Sulfo-SMCC çözüm 40 µL 100 µL RGD-NH2 ekleyin ve 20 dk için kuluçkaya.
        Not: NHS ester sulfo-SMCC içinde bir Amid bağı oluşturan RGD-NH2, amin grubuyla bağlantılı RGD ve sulfo-SMCC tepki olacaktır.
    3. RGD-SMCC SH-ssDNA-içki ile eşlenik.
      1. 1.2.1 ve 1.2.2 adımlarını hazır çözümler mix ve karışımı oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Bir buzdolabı set 4 ° C'de çözüm taşımak ve daha fazla gecede tepki sağlar. Üst iplikçik DNA üzerinde Birleşik thiol maleimide ile sulfo-SMCC RGD üst iplikçik DNA ile bağlanan bir thioether grubu oluşturan, tepki.
    4. Unreacted sulfo-SMCC, RGD ve TCEP RGD-ssDNA-içki arındırmak için etanol yağış gerçekleştirin.
      1. 10 mL % 100 etanol 15 mL konik tüp için en az 30 dakika-20 ° C-dondurucu soğuk.
      2. 3 M NaCl çözüm, DNA çözüm ve hacim oranı 1:10:25 itibariyle soğuk etanol karıştırın. Karışık sıvı 30 dk ya kadar DNA çöktürülmüş-20 ° C-dondurucu içinde tutun.
      3. 30 dakika süreyle santrifüj 10.000 x g de sıvı süpernatant atmak.
      4. PBS DNA Pelet ekleyin. Bir Spektrometre kullanılarak DNA toplama ölçmek.
    5. (İsteğe bağlı) Daha yüksek bir RGD-ssDNA saflık kazanmak için DNA Elektroforez gerçekleştirin.
      Not: Yukarıdaki protokolü ile yaklaşık % 70-% 90 ssDNA RGD ile Birleşik. Daha yüksek saflık isterseniz, DNA Elektroforez da konjuge DNA çekimsiz DNA'dan ayırmak için gerçekleştirilebilir.
      1. Bir Dikey Elektroforez sistemi monte.
      2. % 10 polyacrylamide jel çözüm 50 mL saf su, 20 mL % 40 Akrilamid jel, tris-Bor-EDTA (TBE) arabellek x 10 8 mL ve 800 µL % 10 amonyum persülfat (APS) karıştırarak hazırlayın.
      3. Tetramethylethylenediamine (TEMED) 80 µL jel ekleyin. Çözüm Elektroforez Sistemi cam odanın içine dökün. Bir de üstüne jel oluşturmak için bir tek iyi tarak yerleştirin. 10 dakikadır jel çapraz gelene kadar bekle.
      4. DNA çözüm 1:1 bir hacim oranı, % 100 gliserol ile karıştırın. Tarak kaldırın ve jel DNA çözüm de yük.
      5. Jel ahşap kaplama bir konjüge DNA olduğu 200 V. gözlemlemek iki DNA grup bir gerilim çalıştırın.
      6. Konjuge DNA jel grupla kes ve küçük parçalar halinde zar.
      7. İki 1,5 mL santrifüj tüpleri doğranmış jel filtreleri ile toplamak. PBS 500 µL her tüp için ekleyin.
      8. PBS bulanmış jel 1 gün için oda sıcaklığında karanlık bir yere koyun. DNA jel parçalar dışında PBS yaygın.
      9. Tüpler 1000 x g 2 min için de centrifuging tarafından DNA çözüm toplamak.
      10. Başka bir yuvarlak etanol parçalı bulutlu DNA toplamak için (Adım 1.2.4) gerçekleştirin.
  3. Its RGD-ssDNA-içki ve boya-ssDNA-biotin hybridizing tarafından sentez.
    1. Üst iplikçik ve 1.1:1 molar oranını, alt strand DNA'lar çözümler karıştırın. Karışımı 4 ° C'de Its DNA hibridizasyon tarafından üretmek için gecede devam et.
      Not: 1.1:1 DNA hibridizasyon için molar oranı 1:1 yerine kullanılır. Aşırı RGD-ssDNA-içki tüm boya-ssDNA-biotin RGD-ssDNA-içki ile melezlemek sağlamak için kullanılır. RGD-ssDNA-içki hibridizasyon olmadan Its yüzey kaplama kalitesi etkilemez yüzey kaplama sırasında yıkanması.
    2. Aliquot ve mağaza uzun süreli depolama için-20 ° C'de Its çözüm.
      Not: Depolama arabellek PBS ve depolama konsantrasyonu genellikle 10 µM olması gerekir. Düzenli kullanım için çözüm 4 ° C'de farkedilir kalitesi bozulma olmadan birkaç hafta saklanır.

2. cam popolu Petri yemekler üzerinde Its immobilizing tarafından onun yüzeylerin hazırlanması

Not: kullanılan reaktifler biotinylated sığır serum albumin (BSA-biotin), avidin protein ve Its vardır. Tüm reaktifler ve PBS arabellek on Ice buz kovası ile yaklaşık 0 ° c soğuk.

  1. 0.1 mg/mL BSA-biotin PBS cam popolu Petri kabına (29 mm çapında, 14 mm iyi ile) kuyusu üzerine 200 µL yükleyin. Bir buzdolabında 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. BSA-biotin fiziksel olarak cam yüzeyinde adsorbe.
  2. Bir pipet de kullanarak çözüm dışarı emmek ve PBS 200 µL geri iyi yüzey yıkamak için ekleyin. Bu 3 x çamaşır tamamlamak için yineleyin.
  3. İyi 4 ° C'de 30 dk 50 µg/mL avidin proteinin 200 µL kuluçkaya Yıkama onu PBS ile 3 x. Bu adım sonra avidin protein BSA-biotin bağlar ve cam yüzeyde immobilize olur.
  4. 0,1 µM Its iyi 4 ° C'de 30 dk için 200 µL kuluçkaya PBS ile 3 x ile çanak yıkayın. PBS kuyuda hücre kaplama kadar bırakın. Bu adım sonra biotin etiketiyle Its avidin protein bağlar ve yüzeyde immobilize olur.
    Not: Bir önlem Kaplama kalitesi ve homojenliği Its immobilizasyon sırasında kritik asla kadar kuru Petri kabına yüzey izin vermektir. Tüm reaktifler ve PBS 4 ° C veya yaklaşık 0 ° C çamaşır adımları sırasında su buharlaşma hızı azaltmak için bir buz kovası yardımcı olur ile buz üstünde tutmak, ne zaman PBS kuyudan çizilir.

3. hücre kaplama onun yüzeyler üzerine

  1. Kültür balık keratocytes.
    Not: Burada, örnek olarak Japon balığı (Carassius hava) kullanılır, ancak diğer balık türleri de işe yarayabilir.
    1. Düz uçlu cımbız ile bir balık Balık ölçek bir parça koparmak. Yavaşça ölçeğin cam irtibata ölçeğin iç tarafında ile cam popolu Petri kabına, kuyunun basın. ~ 30 için beklemek de yemeğin cam yüzeyine bağlı kalmak balık ölçek için s.
    2. 1 mL Iscove'nın Dulbecco'nın orta (IMDM) tam orta tam balık ölçek kapsayacak şekilde değiştiren ekleyin. Petri kabına 6-48 h için karanlık ve nemli bir kutu içinde oda sıcaklığında tutmak.
      Not: %79 IMDM + % 20 fetal sığır serum (FBS) + %1 penisilin IMDM tam orta içerir. Oksijen veya CO2 ilave hiçbir kaynağı gereklidir. Su ile ıslatılmış bir kaç kağıt mendil rulo kutusunda yüksek nem korumak için kutusuna bırakılabilir. Balık keratocytes balık ölçek dışarı birkaç saat sonra hücreleri bir levha göç edecek. Bu doku kültürü mikroskopla görülebilir. Genellikle 48 saat canlı hücrelerdir.
  2. Bağlantısını kesin ve keratocytes hücreleri Its yüzeylerde plakası.
    1. Orta hangi balık ölçek kültürlü Petri kabına kaldırın. Çözüm ayırma hücresiyle de 1 x yıkama ve balık ölçek ve 3 dakikadır kuluçkaya ayırmayı çözüm ekleyin.
      Not: Tarifi EDTA çözüm ayırma hücre için aşağıdaki gibidir: 10 x Hanks dengeli tuz çözüm (HBSS) + 1 M HEPES (pH 7,6) 10 mL 100 mL + 10 mL % 7.5 sodyum bikarbonat + 500 mM EDTA + 1 L / H2o 2.4 mL PH 7.4 için ayarlanır.
    2. Tüm hücre çözüm ayırma emmek ve IMDM tam orta ekleyin. Keratocytes nazik pipetting tarafından dağıtmak. Hücre çözüm yoğunluğu istenilen düzeyde (1 x 104– 1 x 105/mL) için ayarlayın. Hücreleri (Bölüm 2 göre hazırlanmış) Its yüzeyinde plaka. Hücreleri, oda sıcaklığında 30 dk önce görüntüleme için kuluçkaya.
      Not: Hücre sayımı ile bir hemasitometre çözüm ayırma ile hücreleri ayırma sonra yapılabilir. Böylece keratocytes geçirmek için yüzey alanı bol yoğunluğu kaplama hücre nispeten azdır.
  3. Plaka CHO-K1 hücreleri ve NIH 3T3 hücreleri onun yüzeylerde.
    Not: CHO-K1 hücreler için orta % 89'ham ' ın F12 + %10 FBS + % 1 penisilin olduğunu. Orta NIH 3T3 hücrelerin % 89 Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) + % 10 buzağı sığır serum (CBS) + %1 penisilin var. 37 ° C ve % 5 CO2kültür koşullardır.
    1. Kültür CHO-K1 hücreleri veya NIH 3T3 hücreleri % 80-%100 izdiham bir Petri kabına (veya kültür şişesi) için.
    2. Çözüm ve kültür orta 37 ° C'ye ayırma hücre sıcak
    3. Tüm kültür orta Petri kabına bir pipet ile kaldırın. Hücreleri 1 yıkama x çözüm ayırma hücre ile. Çözüm ayırma ile hücreleri kapak ve 10 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. Hücreleri pipetting tarafından dağıtmak. Hücre çözümü toplamak ve vasıl 300 x g 3 dk santrifüj kapasitesi.
    5. Süpernatant emmek ve tam orta veya orta serum ücretsiz ekleyin.
    6. Hücre çözüm yoğunluğu istenilen düzeyde (1 x 105 -1 x 106/mL) için ayarlayın. Hücreleri (Bölüm 2 göre hazırlanmış) Its yüzeylerde plaka. Video kaydı önce görüntüleme veya 30 dk önce 1-2 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.

4. görüntüleme, video kayıt ve gerçek zamanlı integrin gerginlik eşleme

  1. İntegrin gerginlik canlı hücrelerdeki Quasi-Real-Time görüntüleme
    1. Keratocytes yüzeylerde (Bölüm 2 göre hazırlanmış) onun için oda sıcaklığında 30 dk kuluçkaya veya CHO-K1 hücreleri veya NIH 3T3 hücreleri bir kuluçka 37 ° C'de onun yüzeylerde 1 h için kuluçkaya
    2. Petri kabına bir floresan mikroskop sahneye bağlayın. 1 bir çekim hızı ile hücresel kuvvet görüntülemede gerçekleştirmek s. Büyütme 40 x veya 100 x var.
    3. ONUN görüntüleri video 20 çerçeve aralığı ile çekmek s keratocytes veya CHO-K1 hücreler veya NIH 3T3 hücreleri için 1-2 dk için.
    4. Yeni son kare aralığı içinde üretilen Its sinyal hesaplamak için geçerli çerçeve Its videodan bir önceki kare çıkarma için MATLAB veya başka bir görüntü analiz aracı kullanın. Yeni üretilen Its sinyal böylece hücresel güç quasi-real-time bir şekilde raporlama son kare aralığı içinde oluşturulan integrin gerginlik temsil eder.
  2. İntegrin gerginlik ve immunostained hücreleri hücresel yapısında coimaging
    1. Adım 3.2.2 veya adım 3.3.6 sonra hedef yapısal proteinler işaretlemek için immunostaining yerine getirir.
      Not: farklı boya Floresans crosstalk integrin gerginlik görüntüleme ve hücre yapısal görüntüleme arasında önlemek için kullanın. Bu makale, Cy5 fluorophore phalloidin için kullanıldı ve Alexa 488 vinculin boyama için kullanıldı. Birincil ve ikincil antikor 2,5 µg/mL bölgedir. Phalloidin için 1,5 birimleri/µL bölgedir.
    2. Bir integrin gerginlik harita ve hücre yapısal görüntüleme elde etmek için multifluorescent kanal görüntüleme gerçekleştirmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Its ile balık keratocytes integrin gerginlik Haritası ele geçirildi. Bu bir keratocyte geçirir ve integrin gerilim iki kuvvet parçaları (şekil 2A) üretir gösterir. Kuvvet harita çözünürlüğü 0.4 µm (şekil 2B) için kalibre. Yüksek integrin gerginlik arka kenar boşluklarını (şekil 3A) yoğunlaşmaktadır. Its Ayrıca farklı hücre farklı belirli desen gösterir. Nonmotile hücrede NIH-3T3, belirli integrin gerginlik desen (şekil 3B) oldukça hızlı geçirme keratocyte farklı oluşturur.

İmmunostaining ile odak yapışıklıklar ve integrin gerginlik balık keratocytes edildi (şekil 4A) coimaged. İntegrin gerginlik ve keratocytes hücre yapısında ilişkisi Wang ve ark.25tarafından ayrıntılı olarak incelenmiştir. Integrin gerginlik ve stres lifler CHO-K1 hücrelerdeki da coimaged (şekil 4B) idi. Bu deneyler Its hücre adezyon gücü ve hücre yapıları aynı anda benzer görüntüleme ayarları böylece hücre yapısı/kuvvet Interplay çalışma kolaylaştırmak altında coimaging sağlar gösterir.

Figure 1
Şekil 1: şemaları kendi. Its RGD ligand, Floresans içki, bir boya ve biotin etiketi ile dekore edilmiş bir dsDNA var. Boya (yeşil dolu Daire) tarafından içki söndürülür. İntegrin gerilim altında dsDNA yırtıldı ve Cy3 Şoklama üzerinden serbest bırakıldı ve floresan mikroskopi tarafından tespit edilebilir Floresans yayar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: bir balık keratocyte ve Its Mikronaltı çözünürlüğe Integrin gerginlik Haritası. (A)hızlı geçiş sırasında bir keratocyte sürekli olarak iki kuvvet parça integrin gerginlik eşlemesi oluşturur. (B) ikisi arasındaki mesafe kuvvet parça olduğunu genellikle 40 µm. Kayma Its tarafından yansıma hücresel kuvvet harita 0.4 µm çözümlemesidir. Alt sol panelinde kısa bir kırmızı çizgi ile işaretlenmiş alan Cy3 floresan yoğunluğu doğrusal profil hücresel kuvvet görüntüleme çözümünde kalibrasyon için hesaplanır. Sonuç alt sağdaki bölmede gösterilen ve bir Gauss eğrisi ile donatılmış. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Resim 3: bir balık keratocyte ve NIH 3T3 gerçek zamanlı integrin gerginlik Haritası. (A) A balık keratocyte ve onun integrin gerginlik harita. (Sol üst) Hareketli balık keratocyte. (Sol alt) Integrin gerginlik Its tarafından bildirilen keratocyte Haritası. (Sağ üst) Gerçek zamanlı integrin gerginlik çerçeve çıkarma tarafından elde edildi. Bu yeni oluşturulan integrin gerginlik hücre arka kenar ile colocalized gösterir. (Sağ alt) Integrin gerginlik harita (yeşil) ve gerçek zamanlı integrin gerilim (macenta) bir birleştirilmiş şekilde sunulmaktadır. Ölçek çubuğu 10 µm. (B) bir NIH 3T3 = fibroblast ve onun integrin gerginlik harita. (Sol üst) Bir NIH 3T3 fibroblast. (Sol alt) Integrin gerginlik NIH 3T3 fibroblast Haritası. Integrin gerginlik bir şerit desende oluşturulmuştur. (Sağ üst) Gerçek zamanlı integrin gerginlik yeni oluşturulan integrin gerginlik esas olarak hücre periferik bölgenin formları gösterir. (Sağ alt) Integrin gerginlik harita (yeşil) ve gerçek zamanlı integrin gerilim (macenta) bir birleştirilmiş şekilde sunulmaktadır. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: integrin gerginlik ve hücre yapısının Coimaging. (A)Coimaging integrin gerginlik, vinculin ve F-aktin bir keratocyte içinde. Keratocyte tespit edildi ve vinculin ve F-aktin bildirmek için immunostained. (B) Coimaging integrin gerginlik, vinculin ve F-aktin CHO-K1 hücrede. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cep için güçlü teknik zorlamak henüz sentezi ve uygulama açısından eşleme Its son derece erişilebilir değil. Tüm malzemeler hazır Its 1 gün içinde sentez. Deneyler sırasında yüzey kaplama sadece üç adımdan önce hücre kaplama ihtiyaç vardır. Son zamanlarda, biz daha fazla bir adım kaplama yordamına doğrudan sığır serum albümin, cam veya polistiren yüzeyler33Its doğrudan fiziksel adsorpsiyon sağlayan Its bağlayarak Basitleştirilmiş. Its hücresel güç sinyal hücresel yapısal görüntüleme karşılaştırılabilir bir seviyeye floresan yoğunluğu getiriyor. Uygun sentez ve numune hazırlama ve yüksek hassasiyet için hücresel kuvvet mikroskobu mütevazı gereksinimleri Its hücre mekaniğinin çalışma için sağlam ve güvenilir teknik olun. Bu yazıda, sentez ve uygulama kapsamlı bir yordam sunduk.

RGD conjugating ligand ssDNA ile Its sentez en kritik bir yöntemdir. Protokol bölümünde belirtildiği gibi sulfo-SMCC üzerinde NHS ester su sabit değil. Sulfo-SMCC su içinde çözülmeye uzun sürerse, sulfo-SMCC daha fazla miktarda NHS ester hidroliz için kaybeder ve "dandik" DNA'sı ile maleimide-thiol tepki conjugates ama RGD-NH2ile çekimlerine başarısız olur, olur. Sonuç olarak, DNA moleküllerinin büyük bir kısmı ölü sulfo SMCC tarafından işgal ve ssDNA RGD düşük bir verim için önde gelen RGD ile bağlayamazsınız. Bu nedenle, sulfo-SMCC su içinde eriterek hızlı bir şekilde, genellikle 1 dk içinde tamamlanmalıdır. Ayrıca ssDNA-RGD Elektroforez ile verim kontrol etmek için önerilir. Arıtma verimi % 80 yüksek ise, genellikle gereksizdir. Aksi takdirde, DNA arıtma polyacrylamide jel tarafından önerilir. Kurtarma DNA tarafından polyacrylamide jel yaklaşık % 60-%80 oranıdır.

RGD-ssDNA-BHQ2makul bir miktarda sentez thiol-ssDNA-BHQ2 başlangıç miktarı en az 20 nmol (1 mM x 20 µL) olması gerekir. DNA değişiklikler önemli ölçüde ssDNA DNA şirketlerden sipariş miktarını azaltmak unutmayın. Örneğin, ssDNA iki değişiklikler ile 1.000 nmol sipariş ettiyseniz, garantili verim sadece 20 nmol olabilir. Bu durumda ise, en az 1000 nmol ssDNA RGD-ssDNA fiil için sipariş. Araştırmacılar Ayrıca kendi yapıları için kendi sıralarını tasarlayabilirsiniz. Normalde, GC içerik dsDNA termal kararlılığınızı geliştirmek için Its içinde 70 daha yüksek tutmak. Öz-saç tokası, kendi kendine hibridizasyon, istikrarlı ikincil yapı, vb kurma olasılığını en aza indirmek için DNA dizi analizi yapılabilir. Çözümleme aracı çevrimiçi kullanılabilir. El yazması, üst iplikçik DNA için Itss farklı Ttolile aynıdır. Biz alt iplikçik DNA farklı bir Ttolulaşmak için biotin konumu değişir. Ancak, üst iplikçikteki RGD konumunu değişen Its Ttol ayarlamak için uygulanabilir. Ttol için farklı dsDNA Geometri Hesaplama Wang ve Ha22 ve Mosayebi ve ark.34, özellikle için dsDNA unzipping modu35,36 ve kesme modunda tarafından sağlanan 37,38.

Her ne kadar onun yüzeyler geçmişte, arka arkaya hücresel kuvvet haritanın bir video kaydı tarafından meydana gelmiş bütün integrin gerginlikler kaydetmek, araştırmacılar bir önceki çerçeveyi çıkararak en son kare aralığı içinde üretilen integrin gerilim hesaplaması 'quasi-real-time hücresel kuvvet harita' oluşturmak için geçerli çerçeve. Its video çerçeve aralığı hücre türlerine bağlı olarak değişir ama genellikle 20 s hızlı geçiş hücreleri ve sabit hücreler için 1-2 dk için. Kare çıkarma yöntemi için integrin gerginlik düşsel sinyal birikimi etkisi nedeniyle yüksek hassasiyet korurken quasi-real-time integrin gerginlik bildirir. Photobleaching iki ardışık görüntüler arasında en az düzeydedir ve bu nedenle, çerçeve çıkarma yöntemi gözlemlenebilir hiçbir etkisi yoktur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser tarafından Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü (R35GM128747) ve Iowa State Üniversitesi tarafından sağlanan başlangıç Fonu tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA-biotin Sigma-Aldrich A8549
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Streptavidin Thermo Fisher Scientific 434301
upper strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section
lower strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific A39268
Cyclic peptide RGD with an amine group Peptides International PCI-3696-PI
IMDM ATCC ‎62996227
FBS ATCC 302020
Penicillin gibco 15140122
TCEP Sigma-Aldrich C4706
200 uL petri dish Cellvis D29-14-1.5-N
NanoDrop 2000 Thermo Scientific N/A spectrometer
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit Hoefer SE410-15-1.5 Device for electroporesis
CHO-K1 cell line ATCC CCL-61
NIH/3T3 cell line ATCC CRL-1658
Anti-Vinculin Antibody EMD Millipore 90227 Primary antibody for vinculin immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A28175 Secondary antibody for vinculin immunostaining
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287
Eclipse Ti Nikon N/A microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
  2. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  3. Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
  4. Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
  5. Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
  6. Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
  7. Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
  8. Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
  9. Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
  10. Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
  11. Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
  12. Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
  13. Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
  14. Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 235-244 (2017).
  15. Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  16. Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
  17. Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
  18. Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
  19. Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  20. Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
  21. Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
  22. Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
  23. Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
  24. Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
  25. Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
  26. Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
  27. Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
  28. Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
  29. Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  30. Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
  31. Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
  32. Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
  33. Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
  34. Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
  35. Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
  36. Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
  37. de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
  38. Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).

Tags

Geri çekilmesi sayı: 146 hücre mekaniği mechanobiology integrin integrin gerginlik hücresel kuvvet eşleme integrin gerilim sensör
Integrin gerginlik ve hücresel kuvvet bütünleştirici gerilim sensör ile Mikronaltı çözünürlükte görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X.… More

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor. J. Vis. Exp. (146), e59476, doi:10.3791/59476 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter