Поколение трехмерных коллагеновых гидрогелей для анализа аксоналального роста и поведения при развитии нервной системы
Summary
Здесь мы предоставляем метод анализа поведения растущих аксонов в 3D матрицах, имитирующих их естественное развитие.
Abstract
Этот протокол использует естественный коллаген i типа для того чтобы произвести трехмерный (3-D) гидрогель для контролировать и анализировать рост аксонального. Протокол сосредоточен на культивировании небольших кусочков эмбрионального или раннего послеродового мозга грызунов внутри 3-D гидрогеля, образованного коллагеном типа I, полученным от хвоста крысы. Части тканей культивируются внутри гидрогеля и сталкиваются с конкретными фрагментами мозга или генетически модифицированными клеточными агрегатами для производства и выделения молекул, пригодных для создания градиента внутри пористой матрицы. Шаги этого протокола просты и воспроизводимы, но включают критические шаги, которые необходимо тщательно рассмотреть при его разработке. Кроме того, поведение растущих аксонов можно контролировать и анализировать непосредственно с помощью фазово-контрастного микроскопа или моно/мультифотонного флуоресцентного микроскопа после фиксации иммуноцитохимическими методами.
Introduction
Нейронные аксоны, заканчивающиеся аксоновыми конусами роста, мигрируют на большие расстояния через внеклеточную матрицу (ECM) эмбриона по определенным путям для достижения соответствующих целей. Конус роста дистальная часть аксона и специализируется на чувстве физической и молекулярной среды клетки1,2. С молекулярной точки зрения, рост конусов руководствуются по крайней мере четыре различных молекулярных механизмов: контакт притяжения, химиоаттракцион, контактное отталкивание, и chemorepulsion вызвано различными аксональных сигналов руководства3,4 , 5 , 6. Контактные процессы могут быть частично контролироваться в двухмерных (2D) культурах на микроузорчатых субстратах (например, с полосами7,8 или пятнами9, содержащими молекулы). Тем не менее, аксоны могут перемещаться к своей цели в недиффузной манере, чувствуянесколько привлекательных и отталкивающих молекул из клеток направляющего столба в окружающей среде 4,5,10. Здесь мы описываем простой метод трех-D культуры, чтобы проверить, является ли секретная молекула вызывает chemorepulsive или химиопривлекательные эффекты на развивающихся аксонов.
Самые ранние исследования, направленные на определение эффектов аксон руководства сигналы использовали explant культур в трехмерных (3-D) матрицы для создания градиентов, имитирующих в условиях vivo11,12. Этот подход, наряду с экспериментами in vivo, позволил выявить четыре основных семейства наведения сигналов: Netrins, Slits, Semaphorins, и Ephrins4,5,6. Эти молекулярные сигналы и другие факторы13 интегрированы растущими аксономи, запуская динамику адгезионных комплексов и преобразуя механические силы через цитоскелет14,15,16. Для генерации молекулярных градиентов в трех-D культур для аксональной навигации, новаторские исследователи использовали плазменный сгусток субстратов17, который также был использован для органотипических срез препаратов18. Тем не менее, в 1958 году, новый протокол для создания 3-D коллагена гидрогели было сообщено для изучения с устройствами Максимова19, культурная платформа, используемая в нескольких исследованиях, пригодных для микроскопических наблюдений20. Другое исследование пионера сообщили коллагена гель в качестве инструмента для встраивания человека фибробластов для изучения дифференциации фибробластов в миофибробласты в процессах заживления ран21. Параллельно, Ламсден и Дэвис применяется коллаген из бычьей дермы для анализа преображаемого влияния фактора роста нерва (NGF) на руководящих сенсорных нервных волокон22. С развитием новых культурных платформ (например, многоколодцных пластин) различными компаниями и лабораториями, коллагеновые культуры были адаптированы к этим новым устройствам6,23,24,25 ,26. Параллельно, экстракт материала ECM, полученных из Линии опухолевых клеток Энгельбрета-Хольма-Срой, был коммерчески доступен для расширения этих исследований27.
Недавно было разработано несколько протоколов для генерации молекулярных градиентов с исходными ролями в аксоне, используя 3-D гидрогели (например, коллаген, фибрин и т.д.) 28. Кроме того, молекула-кандидат может быть обездвижена в разной концентрации в пористой матрице (например, NGF29) или порождена путем культивирования в небольшой области 3-D гидрогелевной клетки агрегатов, выделяющих молекулу для генерации радиальной градиент4,23,24,25,26. Последняя возможность будет объяснена в этом протоколе.
Процедура, представленная здесь, является простым, быстрым и высоко воспроизводимым методом, основанным на анализе аксонального роста в трехмерных гидрогелевы химкультурэмбрионных культурах эмбрионального мозга мыши. По сравнению с другими методами, протокол хорошо подходит для неподготовленных исследователей и может быть полностью разработан после короткого обучения (1-2 недели). В этом протоколе мы сначала изолируем коллаген от взрослых крысиных хвостов для дальнейшего создания 3-D матриц, в которых генетически модифицированные клеточные агрегаты культивируются перед эмбриональной нейронной тканью. Эти клеточные агрегаты образуют радиальные химические градиенты молекулы-кандидата, которые вызывают реакцию на растущие аксоны. Наконец, оценка влияния молекулы на растущие аксоны может быть легко выполнена с помощью фазовой контрастной микроскопии или, в качестве альтернативы, иммуноцитохимических методов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рост развивающихся аксонов в основном инвазивный и включает в себя деградацию и ремоделирование ECM. Используя представленную здесь процедуру, исследователи могут получить однородную трехмерную матрицу, образованную коллагеном природного типа I, в котором аксоны (или клетки) могут реа?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Тома Иоганнана за редакционную консультацию и М. Сегуру-Фелиу за техническую помощь. Эта работа финансировалась Программой CERCA и Комиссией по университетам и исследованиям Департамента инноваций, университетов и предприятий Общего управления Каталонии (SGR2017-648). Эта работа была профинансирована испанским министерством исследований, инноваций и университета (MEICO) через BFU2015-67777-R и RTI2018-099773-B-100, испанской prion Network (Prionet Spain AGL2017-90665-REDT), и Институт Карлосiii, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5-ml conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15-ml conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200-ml centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200-ml sterile glass conical flasks | |||
| 2-litre glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 ºC, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar | ||
Riferimenti
- Ramón y Cajal, S. . Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l’homme et chez les vertébrés. , (1894).
- Ramón y Cajal, S. . Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
- Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
- Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
- Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
- Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
- Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Castellani, V. B. . Protocols for Neuronal Cell Culture. , (2001).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
- Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
- Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
- Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
- Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
- Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
- Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
- Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
- Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
- Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
- Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
- Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
- Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the ‘Bornstein legacy’: from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).
