Здесь мы предоставляем метод анализа поведения растущих аксонов в 3D матрицах, имитирующих их естественное развитие.
Этот протокол использует естественный коллаген i типа для того чтобы произвести трехмерный (3-D) гидрогель для контролировать и анализировать рост аксонального. Протокол сосредоточен на культивировании небольших кусочков эмбрионального или раннего послеродового мозга грызунов внутри 3-D гидрогеля, образованного коллагеном типа I, полученным от хвоста крысы. Части тканей культивируются внутри гидрогеля и сталкиваются с конкретными фрагментами мозга или генетически модифицированными клеточными агрегатами для производства и выделения молекул, пригодных для создания градиента внутри пористой матрицы. Шаги этого протокола просты и воспроизводимы, но включают критические шаги, которые необходимо тщательно рассмотреть при его разработке. Кроме того, поведение растущих аксонов можно контролировать и анализировать непосредственно с помощью фазово-контрастного микроскопа или моно/мультифотонного флуоресцентного микроскопа после фиксации иммуноцитохимическими методами.
Нейронные аксоны, заканчивающиеся аксоновыми конусами роста, мигрируют на большие расстояния через внеклеточную матрицу (ECM) эмбриона по определенным путям для достижения соответствующих целей. Конус роста дистальная часть аксона и специализируется на чувстве физической и молекулярной среды клетки1,2. С молекулярной точки зрения, рост конусов руководствуются по крайней мере четыре различных молекулярных механизмов: контакт притяжения, химиоаттракцион, контактное отталкивание, и chemorepulsion вызвано различными аксональных сигналов руководства3,4 , 5 , 6. Контактные процессы могут быть частично контролироваться в двухмерных (2D) культурах на микроузорчатых субстратах (например, с полосами7,8 или пятнами9, содержащими молекулы). Тем не менее, аксоны могут перемещаться к своей цели в недиффузной манере, чувствуянесколько привлекательных и отталкивающих молекул из клеток направляющего столба в окружающей среде 4,5,10. Здесь мы описываем простой метод трех-D культуры, чтобы проверить, является ли секретная молекула вызывает chemorepulsive или химиопривлекательные эффекты на развивающихся аксонов.
Самые ранние исследования, направленные на определение эффектов аксон руководства сигналы использовали explant культур в трехмерных (3-D) матрицы для создания градиентов, имитирующих в условиях vivo11,12. Этот подход, наряду с экспериментами in vivo, позволил выявить четыре основных семейства наведения сигналов: Netrins, Slits, Semaphorins, и Ephrins4,5,6. Эти молекулярные сигналы и другие факторы13 интегрированы растущими аксономи, запуская динамику адгезионных комплексов и преобразуя механические силы через цитоскелет14,15,16. Для генерации молекулярных градиентов в трех-D культур для аксональной навигации, новаторские исследователи использовали плазменный сгусток субстратов17, который также был использован для органотипических срез препаратов18. Тем не менее, в 1958 году, новый протокол для создания 3-D коллагена гидрогели было сообщено для изучения с устройствами Максимова19, культурная платформа, используемая в нескольких исследованиях, пригодных для микроскопических наблюдений20. Другое исследование пионера сообщили коллагена гель в качестве инструмента для встраивания человека фибробластов для изучения дифференциации фибробластов в миофибробласты в процессах заживления ран21. Параллельно, Ламсден и Дэвис применяется коллаген из бычьей дермы для анализа преображаемого влияния фактора роста нерва (NGF) на руководящих сенсорных нервных волокон22. С развитием новых культурных платформ (например, многоколодцных пластин) различными компаниями и лабораториями, коллагеновые культуры были адаптированы к этим новым устройствам6,23,24,25 ,26. Параллельно, экстракт материала ECM, полученных из Линии опухолевых клеток Энгельбрета-Хольма-Срой, был коммерчески доступен для расширения этих исследований27.
Недавно было разработано несколько протоколов для генерации молекулярных градиентов с исходными ролями в аксоне, используя 3-D гидрогели (например, коллаген, фибрин и т.д.) 28. Кроме того, молекула-кандидат может быть обездвижена в разной концентрации в пористой матрице (например, NGF29) или порождена путем культивирования в небольшой области 3-D гидрогелевной клетки агрегатов, выделяющих молекулу для генерации радиальной градиент4,23,24,25,26. Последняя возможность будет объяснена в этом протоколе.
Процедура, представленная здесь, является простым, быстрым и высоко воспроизводимым методом, основанным на анализе аксонального роста в трехмерных гидрогелевы химкультурэмбрионных культурах эмбрионального мозга мыши. По сравнению с другими методами, протокол хорошо подходит для неподготовленных исследователей и может быть полностью разработан после короткого обучения (1-2 недели). В этом протоколе мы сначала изолируем коллаген от взрослых крысиных хвостов для дальнейшего создания 3-D матриц, в которых генетически модифицированные клеточные агрегаты культивируются перед эмбриональной нейронной тканью. Эти клеточные агрегаты образуют радиальные химические градиенты молекулы-кандидата, которые вызывают реакцию на растущие аксоны. Наконец, оценка влияния молекулы на растущие аксоны может быть легко выполнена с помощью фазовой контрастной микроскопии или, в качестве альтернативы, иммуноцитохимических методов.
Рост развивающихся аксонов в основном инвазивный и включает в себя деградацию и ремоделирование ECM. Используя представленную здесь процедуру, исследователи могут получить однородную трехмерную матрицу, образованную коллагеном природного типа I, в котором аксоны (или клетки) могут реа?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Тома Иоганнана за редакционную консультацию и М. Сегуру-Фелиу за техническую помощь. Эта работа финансировалась Программой CERCA и Комиссией по университетам и исследованиям Департамента инноваций, университетов и предприятий Общего управления Каталонии (SGR2017-648). Эта работа была профинансирована испанским министерством исследований, инноваций и университета (MEICO) через BFU2015-67777-R и RTI2018-099773-B-100, испанской prion Network (Prionet Spain AGL2017-90665-REDT), и Институт Карлосiii, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Material | |||
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
cDNA plasmid vectors | |||
COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
Ethanol | merck | 108543 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
Sodium azide | Panreac | 162712 | |
Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
Trizma base | Sigma | T1503 | |
Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
Equipment | |||
1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
1.5-ml conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
15-ml conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
200-ml centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
200-ml sterile glass conical flasks | |||
2-litre glass beaker | |||
4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
Cell culture incubator at 37 ºC, 5% CO2 and 95% air | |||
Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
Disposable glass pipettes | |||
Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
Laminar flow hood | |||
Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
Razor blades for the tissue chopper | |||
Scalpels (number 15 and 11) | |||
Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar |