Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi
Summary
Burada, 3D matrislerde büyüyen akons davranışlarını analiz etmek, doğal gelişimini taklit etmek için bir yöntem sağlıyoruz.
Abstract
Bu protokol, aksal büyümeyi izlemek ve analiz etmek için üç boyutlu (3-D) hidrojel oluşturmak için doğal tip ı kollajen kullanır. Protokol, küçük parça embriyonik veya erken postnatal kemirgen beyinleri içinde bir 3-D hidrojel tarafından oluşturulan sıçan kuyruk tendon-türetilmiş tip ı kollajen özel gözenekliliği ile kurulan üzerinde ortalanır. Doku parçaları hidrojel içinde kültürlü ve spesifik beyin parçaları veya genetiği değiştirilmiş hücre agregaları üretmek ve gözenekli matris içinde bir degrade oluşturmak için uygun molekülleri salgılama karşı karşıya. Bu protokolün adımları basit ve yeniden oluşturulabilir ancak geliştirme sırasında dikkatle değerlendirilecek kritik adımları içerir. Dahası, büyüyen akuçların davranışı, immünositoz metotları ile tespit edildikten sonra faz kontrast mikroskop veya mono/multifoton floresan mikroskobu kullanılarak doğrudan izlenebilir ve analiz edilebilir.
Introduction
Akal büyüme konileri ile biten nöronal akons, uygun hedeflere ulaşmak için belirli yollar üzerinde embriyonun ekstrellüler matris (ECM) aracılığıyla uzun mesafeler göç. Büyüme koni Axon distal parçasıdır ve hücrenin fiziksel ve moleküler çevre duygusu uzmanlaşmıştır1,2. Moleküler açıdan göre, büyüme konileri en az dört farklı Moleküler mekanizma tarafından yönlendirilir: temas cazibe, chemoattraction, kontak itme, ve chemorepulsion farklı aksonal rehberlik ipuçları tarafından tetiklenen3,4 , 5 , 6. kontakt-aracılı süreçler, mikro desenli substratlar üzerinde iki boyutlu (2D) kültürlerde kısmen izlenebilir (örn. çizgiler7,8 veya molekülleri içeren9 nokta ile). Ancak, akons çevre4,5,10içinde mavi mesaj hücrelerinden birkaç çekici ve itici molekülleri algılayarak kendi hedeflerine diffusive olmayan bir şekilde gidebilirsiniz. Burada, bir salgılanmış molekülün gelişen akons üzerinde chemorepulsive veya chemocazip etkileri indükler olup olmadığını kontrol etmek için 3-D kültürün kolay bir yöntem açıklanmaktadır.
Axon rehberlik ipuçlarının etkilerinin belirlenmesine yönelik en erken çalışmalar, üç boyutlu (3-b) matrislerde eksplant kültürlerini kullanarak gradyanlar içinde vivo koşullar11,12simüle oluşturur. Bu yaklaşım, in vivo deneyler ile birlikte, rehberlik ipuçlarını dört büyük ailelerin tanımlanması için izin: netrins, yırtkıları, semaforinler, ve ephrins4,5,6. Bu moleküler ipuçları ve diğer faktörler13 büyüyen akons tarafından entegre edilir, yapışma kompleksler dinamikleri tetikleyen ve sitentresi aracılığıyla mekanik Kuvvetleri dönüştürücüler14,15,16. Aksonal navigasyon için 3-b kültürlerde moleküler degradeler oluşturmak için, öncü araştırmacılar da organotypic dilim preparatları için kullanılan plazma pıhtı substratlar17, kullanılan18. Ancak, 1958 yılında, 3-b kollajen Hidrojeller oluşturmak için yeni bir protokol maximow ‘s cihazları19, bir kültür platformu, mikroskobik gözlem20için uygun çeşitli çalışmalarda kullanılan bir eğitim için bildirilmiştir. Başka bir öncü çalışma, fibroblastların yara iyileşmesi süreçlerinde myofibroblastlar halinde farklılaşması için insan fibroblastları gömmek için bir araç olarak kollajen jel bildirdi21. Paralel olarak, Lumsden ve Davies duygusal sinir liflerinin rehberlik üzerinde sinir büyüme faktörü (NGF) Putatif etkisini analiz etmek için sığır dermis kollajen uygulanan22. Farklı şirketler ve laboratuvarlar tarafından yeni kültür platformlarının (örn. çok kuyu plakaları) geliştirilmesi ile kollajen kültürler bu yeni cihazlara adapte edildi6,23,24,25 ,26. Paralel olarak, Engelbreth-Holm-Swarm tümör hücre hattından elde edilen ECM malzemesi ekstresi, bu çalışmaları27‘ ye genişletmek için ticari olarak kullanılabilir hale gelmiştir.
Son zamanlarda, 3-b hidrojelleri (örn. kollajen, fibrin vb.) kullanarak Axon rehberliğinde moleküler degradeler oluşturmak için çeşitli protokoller geliştirilmiştir. 28. alternatif olarak, aday molekül bir gözenekli matris (örneğin, NGF29) farklı konsantrasyonda immobilize olabilir veya bir radyal oluşturmak için molekül salgının 3-b hidrojel hücre alların küçük bir bölgede kültür tarafından oluşturulan Gradyan4,23,24,25,26. Son olasılık bu protokolde açıklanacak.
Burada sunulan prosedür, embriyonik fare beynin 3-b hidrojel kültürlerinde akal büyüme analizine dayalı, kolay, hızlı ve son derece tekrarlanabilir bir yöntemdir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, protokol eğitimli olmayan araştırmacılar için de uygundur ve kısa bir eğitimden (1-2 hafta) sonra tamamen geliştirilebilir. Bu protokolde, biz ilk olarak daha fazla üretmek için yetişkin sıçan kuyrukları kollajen yalıtmak 3-b hangi genetiği değiştirilmiş hücre agregaları embriyonik nöronal doku önünde kültürlü olan matris. Bu hücre toplamları, büyüyen akons için bir yanıt gösteren bir aday molekül radyal kimyasal degradeler formu. Son olarak, moleküllerin büyüyen akons üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi, bir faz kontrast mikroskobu veya alternatif olarak immünosittokimyasal yöntemler kullanılarak kolayca yapılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gelişen akonların büyümesi ağırlıklı olarak invaziv olup ECM bozulması ve yeniden modelleme içerir. Burada sunulan prosedürü kullanarak, araştırmacılar, doğal tip ı kollajen tarafından oluşturulan homojen bir 3-b matris elde edebilirsiniz hangi akons (veya hücreler) genetik olarak değiştirilmiş hücreler tarafından salgılanan bir kimyasal degrade yanıt verebilir onlar in vivo gibi. Çekici veya inhibitör ipuçları (protein, lipidler, vb) degradeler için farklı aksal tepkiler kolayca belirli …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, teknik yardım için editoryal tavsiye ve M. Segura-Feliu için Tom Yohannan teşekkür ederiz. Bu çalışma CERCA programı tarafından ve üniversiteler ve Inovasyon, üniversiteler ve Generalitat de Catalunya (SGR2017-648) Işletme departmanı Araştırma Komisyonu tarafından finanse edilmiştir. Bu çalışma, Ispanyol araştırma, yenilik ve üniversite (MEICO) BFU2015-67777-R ve RTI2018-099773-B-100, Ispanyol prion ağı (Prionet Ispanya AGL2017-90665-REDT) ve Enstitüsü Carlos III, CIBERNED (tarafından finanse edildi PRY-2018-2).
Materials
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5-ml conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15-ml conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200-ml centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200-ml sterile glass conical flasks | |||
| 2-litre glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 ºC, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar | ||
Riferimenti
- Ramón y Cajal, S. . Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l’homme et chez les vertébrés. , (1894).
- Ramón y Cajal, S. . Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
- Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
- Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
- Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
- Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
- Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Castellani, V. B. . Protocols for Neuronal Cell Culture. , (2001).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
- Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
- Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
- Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
- Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
- Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
- Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
- Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
- Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
- Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
- Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
- Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
- Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the ‘Bornstein legacy’: from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).
