Un modelo de xenoinjerto derivado del paciente de melanoma
Summary
Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) recapitulan más robustamente las características moleculares y biológicas del melanoma y son más predictivos de la respuesta terapéutica en comparación con los ensayos tradicionales basados en el cultivo de tejido plástico. Aquí describimos nuestro protocolo operativo estándar para el establecimiento de nuevos modelos PDX y la caracterización/experimentación de los modelos PDX existentes.
Abstract
La evidencia acumulada sugiere que las propiedades moleculares y biológicas difieren en las células de melanoma cultivadas en los vasos tradicionales del cultivo de tejido bidimensional frente al in vivo en pacientes humanos. Esto se debe a la selección de cuellos de botella de las poblaciones clonales de células de melanoma que pueden crecer de forma robusta in vitro en ausencia de condiciones fisiológicas. Además, las respuestas a la terapia en cultivos de tejido bidimensional en general no reflejan fielmente las respuestas al tratamiento en pacientes con melanoma, y la mayoría de los ensayos clínicos no muestran la eficacia de las combinaciones terapéuticas que han demostrado ser eficaces en Vitro. Aunque la xenorendurecimiento de las células del melanoma en ratones proporciona el contexto fisiológico in vivo ausente de los ensayos de cultivo de tejido bidimensional, las células de melanoma utilizadas para el injerto ya han sido sometidas a una selección de cuellos de botella para las células que podrían crecer bajo condiciones bidimensionales cuando se estableció la línea celular. Las alteraciones irreversibles que se producen como consecuencia del cuello de botella incluyen cambios en las propiedades de crecimiento e invasión, así como la pérdida de subpoblaciones específicas. Por lo tanto, los modelos que recapitulan mejor la condición humana in vivo pueden predecir mejor las estrategias terapéuticas que aumentan eficazmente la supervivencia global de los pacientes con melanoma metastásico. La técnica de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) implica la implantación directa de células tumorales desde el paciente humano hasta un receptor de ratón. De esta manera, las células tumorales se cultivan constantemente bajo tensiones fisiológicas in vivo y nunca se someten al cuello de botella bidimensional, que preserva las propiedades moleculares y biológicas presentes cuando el tumor estaba en el paciente humano. Notablemente, los modelos PDX derivados de sitios de órganos de metástasis (es decir, cerebro) muestran una capacidad metastásica similar, mientras que los modelos PDX derivados de pacientes ingenuos de terapia y pacientes con resistencia adquirida a la terapia (es decir, terapia inhibidora BRAF/MEK) muestran sensibilidad similar a la terapia.
Introduction
Los modelos preclínicos son críticos para todos los aspectos de la investigación traslacional del cáncer, incluida la caracterización de la enfermedad, el descubrimiento de vulnerabilidades procesables exclusivas del cáncer frente a las células normales, y el desarrollo de terapias eficaces que exploten estas vulnerabilidades para aumentar la supervivencia global de los pacientes. En el campo del melanoma, decenas de miles de modelos de líneas celulares han sido muy utilizados para la detección de drogas, con >4,000 aportados por nuestro grupo solo (serie WMXXX). Estos modelos de líneas celulares se derivaron de pacientes con melanoma con diversas formas de melanoma cutáneo (es decir, difusión acral, uveal y superficial) y diversos genotipos (es decir, BRAFV600-mutante y neuroblastoma RAS homólogo viral oncogó [ NRAS Q61R-mutant]), que abarcan el espectro de la enfermedad presente en la clínica1,2.
Inequívocamente, la estrategia de terapia dirigida más exitosa en el campo del melanoma ha surgido de 1) la caracterización genómica de los tumores de los pacientes que identifican mutaciones BRAF en el 50% de los melanomas3 y de 2) investigación preclínica aprovechando los modelosde la línea celular del melanoma 4. La combinación de inhibidores BRAF/MEK fue aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) en 2014 para el tratamiento de pacientes cuyos melanomas albergan mutaciones BRAFV600E/K y cuenta con una tasa de respuesta de >75%5. A pesar de esta eficacia inicial, la resistencia surge rápidamente en casi todos los casos debido a los mecanismos de resistencia intrínsecos y adquiridos multifacestados y la heterogeneidad intratumoral. Desafortunadamente, los modelos de líneas celulares no recapitulan la heterogeneidad biológica representativa cuando se cultivan en cultivos bidimensionales en recipientes plásticos, lo que enmascara su potencial clínicamente predictivo cuando los investigadores intentan determinar experimentalmente terapias que podrían ser eficaces en pacientes con una forma específica o genotipo de melanoma6. Comprender cómo modelar mejor la heterogeneidad intratumoral del paciente permitirá a los investigadores desarrollar mejor las modalidades terapéuticas que pueden matar a las subpoblaciones resistentes a la terapia que impulsan el fracaso de las terapias estándar de atención actuales.
El valor predictivo limitado de los modelos de línea de celda es cómo se establecen inicialmente. Las alteraciones irreversibles ocurren en el paisaje clonal tumoral cuando se cultiva una suspensión de una sola célula del tumor de un paciente en vasos bidimensionales de cultivo de tejido plástico, incluyendo cambios en el potencial proliferativo e invasivo, la eliminación de subpoblaciones, y la alteración de la información genética7. Los xenoinjertos en ratones de estos modelos de línea celular de melanoma representan la plataforma in vivo más utilizada para estudios preclínicos; sin embargo, esta estrategia también sufre de la mala recapitulación de la heterogeneidad tumoral compleja observada clínicamente. Para superar esta deficiencia, ha habido un creciente interés en incorporar modelos preclínicos más sofisticados de melanoma, incluido el modelo PDX. Los modelos PDX se han utilizado durante >30 años, con estudios seminales en pacientes con cáncer de pulmón que demuestran concordancia entre la respuesta de los pacientes a los agentes citotóxicos y la respuesta del modelo PDX derivado del mismo paciente8. Recientemente, ha habido un impulso para utilizar los modelos PDX como la herramienta de elección para las investigaciones preclínicas tanto en la industria como en los centros académicos. Los modelos PDX, debido a su recapitulación superior de la heterogeneidad tumoral en pacientes humanos,son más relevantes clínicamente para su uso en los esfuerzos de optimización de la terapia que los xenoinjertos de línea celular 9. En el melanoma, hay enormes obstáculos que contenrelan el manejo terapéutico de la enfermedad avanzada10. Los modelos PDX clínicamente relevantes se han utilizado para modelar la resistencia clínica e identificar estrategias terapéuticas con agentes clínicamente disponibles para tratar tumores resistentes a la terapia11,12. Brevemente, el protocolo presentado aquí para generar modelos PDX requiere la implantación subcutánea de tejido fresco a partir de melanomas primarios o metastásicos (recogidos por biopsia o cirugía) en ratones NOD/scid/IL2-receptor null (NSG). Diferentes variaciones en el enfoque metodológico son utilizadas por diferentes grupos; sin embargo, existe un núcleo fundamental13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí hemos descrito la generación de modelos PDX de melanoma con tejido del paciente derivado de tumores primarios y metastásicos, biopsias básicas y FNAs. Cuando se injertan directamente en ratones NSG, los tumores presentan propiedades morfológicas, genómicas y biológicas similares a las observadas en el paciente. En el caso de que sólo una pequeña cantidad de tejido esté disponible para los investigadores, como ocurre a menudo con los FNAs, la técnica PDX permite la expansión del tejido tumoral para la car…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el Wistar Institute Animal Facility, Microscopy Facility, Histotechnology Facility y Research Supply Center. Este estudio fue financiado en parte por subvenciones de la U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), la Fundación de Investigación Médica Dr. Miriam y Sheldon G. Adelson y la Fundación de Investigación del Melanoma.
Materials
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
Riferimenti
- Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Paraiso, K. H., et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).
- Long, G. V., et al. Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib. Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).
- Shi, H., et al. Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).
- Monsma, D. J., et al. Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms. American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Ricerca sul cancro. 77 (21), 62-66 (2017).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- De La Rochere, P., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).
