Bir melanom hasta-türetilen xenograft model
Summary
Hasta-türevi xenograft (PDX) modelleri daha sağlam özetlemek Melanom moleküler ve biyolojik özellikleri ve geleneksel plastik doku kültürü tabanlı asder karşılaştırıldığında tedavi tepkisi daha öngörü vardır. Burada, yeni PDX modellerinin kurulması ve mevcut PDX modellerinin karakterizasyonu/denemeleri için standart çalışma protokollerimizi tarif ediyoruz.
Abstract
Kanıtlar birikir, moleküler ve biyolojik özelliklerin, insan hastalarında geleneksel iki boyutlu doku kültürü damarlarında yetiştirilen Melanom hücrelerinde farklılık gösterdiğini göstermektedir. Bunun nedeni, fizyolojik koşulların yokluğunda, ince olarak büyümek olabilir melanom hücrelerinin klonal nüfus darboğaz seçimi kaynaklanmaktadır. Ayrıca, iki boyutlu doku kültürlerinde tedaviye yanıtlar genel olarak Melanom hastalarında tedaviye yanıtlar yansıtmak değil, klinik çalışmaların çoğunluğu ile etkili olduğu gösterilen terapötik kombinasyonları etkinliğini göstermek için başarısız Vitro. Farelerin içine melanom hücrelerinin ksenograftlanması iki boyutlu doku kültüründen yok fizyolojik in vivo bağlam sağlar rağmen, Engraftman için kullanılan Melanom hücreleri zaten altında büyüyebilir hücreler için darboğaz seçimi geçirmiş hücre hattı kurulduğunda iki boyutlu koşullar. Darboğazın bir sonucu olarak ortaya çıkan geri dönüşümsüz değişiklikler, büyüme ve istila özelliklerinde yapılan değişiklikleri ve belirli alt nüfus kaybını içerir. Bu nedenle, daha iyi insan durumu özetlemek modelleri daha iyi etkili metastatik melanoma hastalarının genel hayatta kalma artırmak terapötik stratejileri tahmin edebilir. Hasta tarafından türetilen xenograft (PDX) tekniği, tümör hücrelerinin insan hastasından bir fare alıcısına doğrudan implantasyonunu içerir. Bu şekilde, tümör hücreleri sürekli olarak fizyolojik stresler altında büyümüştür ve tümör insan hastasındayken mevcut olan moleküler ve biyolojik özellikleri koruyan iki boyutlu darboğaz asla geçmemişti. Metastaz organ sitelerden elde edilen önemli, PDX modelleri (yani, beyin) benzer metastatik kapasite göstermek, PDX modelleri terapi naif hastalar ve terapi elde direnci olan hastalarda elde ederken (yani, BRAF/MEK inhibitörü tedavisi) ekran tedaviye benzer duyarlılık.
Introduction
Preklinik modeller, hastalık karakterizasyonu, normal hücrelere karşı kansere özgü eyleme dönüştürülebilir güvenlik açıkları keşfi ve istismar eden etkili tedavilerin geliştirilmesi gibi translasyonel kanser araştırmalarının tüm yönleri için önemlidir. Bu güvenlik açıkları hastaların genel sağkalım artırmak için. Melanom alanında, on binlerce hücre hattı modeli, uyuşturucu taraması için ağır bir şekilde kullanılmıştır, > 4000 ile grup tek başına (WMXXX serisi) katkıda bulunmuştur. Bu hücre hattı modelleri, çeşitli çeşit kutanöz Melanom (örneğin, acral, uveal ve yüzeysel yayılma) ve çeşitli genotiplerle (yani, BRAFV600-mutant ve Nöroblastom RAS viral onkojen homolog olan Melanom hastalarından türetilmiştir [ NRAS Q61R-mutant]), klinikte bulunan hastalığın spektrumunu kapsayan1,2.
Melanom alanında en başarılı, hedeflenen terapi stratejisi 1 ‘ den ortaya çıkmıştır) hastaların% 50 ‘ inde BRAF mutasyonları tanımlayan genomik karakterizasyonu melanomlar3 ve 2) preklinik soruşturma melanom hücre hattı modelleri yararlanarak4. BRAF/mek inhibitörü kombinasyonu gıda ve İlaç İdaresi (FDA)-2014 yılında melanomlar liman BRAFV600E/K mutasyonlar aktive ve >% 75 yanıt oranı5sahiptir hastaların tedavisi için onaylanmıştır. Bu ilk etkinliğine rağmen, çok yönlü içsel ve elde edilen direnç mekanizmaları ve intratümöral heterojenite nedeniyle neredeyse her durumda direnç hızla ortaya çıkar. Ne yazık ki, hücre hattı modelleri, araştırmacılar deneysel olarak belirlemek için girişimi zaman plastik gemiler, hangi maskeler onların klinik tahmin potansiyeli iki boyutlu kültürde yetiştirilen temsili biyolojik heterojenliği özetlemek yok belirli bir form veya Melanom genotürü olan hastalarda etkili olabilecek tedaviler6. Nasıl en iyi model hasta intratümöral heterojenliği anlamak müfettişlerin daha iyi terapi-dayanıklı altnüfus öldürebilir tedavi yöntemleri geliştirmek için izin verecektir mevcut standart bakım terapileri başarısızlık sürücü.
Hücre hattı modellerinin sınırlı tahmin değeri için Paramount nasıl başlangıçta kurulmuştur. İki boyutlu, plastik doku kültürü gemileri, proliferatif ve invaziv potansiyel değişiklikler de dahil olmak üzere, bir hastanın tümörün tek hücreli süspansiyonu yetiştirilen tümör klonal manzara içinde geri dönüşümsüz değişiklikler ortaya, spesifik eliminasyon alt nüfus ve genetik bilginin değiştirilmesi7. Bu melanom hücre hattı modellerinin fareler içine xenografts preklinik çalışmalar için en sık kullanılan in vivo platform temsil; Ancak, bu strateji de klinik olarak gözlenen karmaşık tümör heterojenitesi yoksul Recapitulation muzdarip. Bu eksikliği aşmak için, PDX modeli de dahil olmak üzere, melanom daha sofistike preklinik modelleri birleştiren büyüyen bir ilgi olmuştur. PDX modelleri, hastaların sitotoksisik ajanlara tepkisi ve aynı hastada8‘ den elde edilen PDX modelinin tepkisi arasında uyum gösteren akciğer kanseri hastalarında seminal çalışmalar ile > 30 yıldır kullanılmıştır. Son zamanlarda, hem sektörde hem de Akademik merkezlerde preklinik araştırmalar için seçim aracı olarak PDX modellerini kullanmak için bir sürücü olmuştur. PDX modelleri, insan hastalarında tümör heterojenitesi onların üstün Recapitulation nedeniyle, daha klinik hücre hattı ksenogreft daha terapi optimizasyonu çabaları kullanmak için ilgilidir9. Melanoma, gelişmiş hastalığın terapötik yönetimi künt büyük engelleri vardır10. Klinik olarak ilgili PDX modelleri klinikte direnç modeli için kullanılan ve tedaviye dayanıklı tümörlerin tedavisinde klinik olarak mevcut ajanlar ile terapötik stratejileri tanımlamak11,12. Kısaca, PDX modelleri oluşturmak için burada sunulan protokol birincil veya metastatik melanomalar (biyopsi veya cerrahi tarafından toplanan) NOD/SCID/ıL2-reseptör null (NSG) fareler içine taze doku subkutan implantasyon gerektirir. Metodolojik yaklaşımlarda farklı varyasyonlar farklı gruplar tarafından kullanılır; Ancak, temel bir çekirdek13var.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada primer ve metastatik tümörlerden, çekirdek biyopsilerin ve FNAs ‘larından elde edilen hasta dokusuyla PDX Melanom modelleri üretilirken tanımlanmıştır. NSG fareler içine doğrudan engreted zaman, tümörlerin benzer morfolojik mevcut, genomik, ve biyolojik özellikleri hastada gözlenen. Sadece küçük bir miktar doku müfettişlere kullanılabilir olduğunda, genellikle FNAs ile ortaya çıktığında, PDX tekniği DNA, RNA ve protein karakterizasyonu için tümör dokusunun genişlemesine ve klinik ö…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Wistar Enstitüsü hayvan tesisi, mikroskopi tesisi, Histoteknoloji tesisi ve araştırma tedarik merkezi teşekkür ederiz. Bu çalışmada U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), Dr. Miriam ve Sheldon G. Adelson Tıp Araştırma Vakfı ve Melanoma Araştırma Vakfı ‘nın hibe tarafından kısmen finanse edilmiştir.
Materials
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
Riferimenti
- Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Paraiso, K. H., et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).
- Long, G. V., et al. Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib. Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).
- Shi, H., et al. Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).
- Monsma, D. J., et al. Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms. American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Ricerca sul cancro. 77 (21), 62-66 (2017).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- De La Rochere, P., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).
