Méthodes pour tester la perturbation endocrinienne dans le mélanogaster drosophila
Summary
Les perturbateurs chimiques endocriniens (CED) représentent un grave problème pour les organismes et pour les milieux naturels. Drosophila melanogaster représente un modèle idéal pour étudier les effets d’EDC in vivo. Ici, nous présentons des méthodes pour étudier la perturbation endocrinienne dans Drosophila, traitant des effets d’EDC sur la fécondité, la fertilité, le moment développemental, et la durée de vie de la mouche.
Abstract
Ces dernières années, il y a eu de plus en plus de preuves que tous les organismes et l’environnement sont exposés à des produits chimiques hormonaux, connus sous le nom de produits chimiques perturbateurs endocriniens (CED). Ces produits chimiques peuvent modifier l’équilibre normal des systèmes endocriniens et entraîner des effets néfastes, ainsi qu’un nombre croissant de troubles hormonaux dans la population humaine ou une croissance perturbée et une reproduction réduite chez les espèces sauvages. Pour certains EDC, il y a des effets documentés sur la santé et des restrictions sur leur utilisation. Cependant, pour la plupart d’entre eux, il n’y a toujours aucune preuve scientifique en ce sens. Afin de vérifier les effets endocriniens potentiels d’un produit chimique dans l’organisme entier, nous devons le tester dans les systèmes modèles appropriés, ainsi que dans la mouche des fruits, Drosophila melanogaster. Ici nous rapportons les protocoles in vivo détaillés pour étudier la perturbation endocrinienne dans Drosophila, traitant des effets d’EDC sur la fécondité/fertilité, le moment développemental, et la durée de vie de la mouche. Au cours des dernières années, nous avons utilisé ces traits de vie Drosophila pour étudier les effets de l’exposition à 17-ethinylestradiol (EE2), bisphénol A (BPA), et bisphénol AF (BPA F). Au total, ces essais couvraient toutes les étapes de la vie de Drosophila et permetaient d’évaluer la perturbation endocrinienne dans tous les processus à médiation hormonale. Les tests de fécondité/fertilité et de synchronisation du développement ont été utiles pour mesurer l’impact d’EDC sur la performance reproductrice de la mouche et sur les stades de développement, respectivement. Enfin, l’exemple de durée de vie impliquait une exposition chronique d’EDC aux adultes et mesurait leur survie. Cependant, ces traits de vie peuvent également être influencés par plusieurs facteurs expérimentaux qui ont dû être soigneusement contrôlés. Donc, dans ce travail, nous suggérons une série de procédures que nous avons optimisées pour le bon résultat de ces essais. Ces méthodes permettent aux scientifiques d’établir une perturbation endocrinienne pour n’importe quelle EDC ou pour un mélange de différentes EDC dans Drosophila, bien que pour identifier le mécanisme endocrinien responsable de l’effet, d’autres essais pourraient être nécessaires.
Introduction
Les activités humaines ont libéré dans l’environnement une quantité massive de produits chimiques, qui représentent un grave problème pour les organismes et pour les écosystèmes naturels1. Parmi ces polluants, on estime qu’environ 1 000 produits chimiques différents peuvent modifier l’équilibre normal des systèmes endocriniens; selon cette propriété, ils sont classés comme produits chimiques perturbateurs endocriniens (EDC). Plus précisément, sur la base d’une définition récente de la Société endocrinienne, les EDC sont « un produit chimique exogène, ou mélange de produits chimiques, qui peut interférer avec n’importe quel aspect de l’action hormonale »2. Au cours des trois dernières décennies, il y a eu de plus en plus de preuves scientifiques que les EDC peuvent affecter la reproduction et le développement des animaux et des plantes3,4,5,6,7, 8. En outre, l’exposition à EDC a été liée à la prévalence croissante de certaines maladies humaines, y compris le cancer, l’obésité, le diabète, les maladies thyroïdiennes, et les troubles du comportement9,10,11.
Mécanismes généraux d’EDC
En raison de leurs propriétés moléculaires, les EDC se comportent comme des hormones ou des précurseurs d’hormones3,5,6,7,8,9, 10,11,12. En ce sens, ils peuvent se lier au récepteur d’une hormone et perturber les systèmes endocriniens soit en imitant l’activité hormonale ou en bloquant les hormones endogènes liant. Dans le premier cas, après la liaison au récepteur, ils peuvent l’activer comme son hormone naturelle ferait. Dans l’autre cas, la liaison de l’EDC au récepteur empêche la liaison de son hormone naturelle, de sorte que le récepteur est bloqué et ne peut plus être activé, même en présence de son hormone naturelle3. En conséquence, les EDC peuvent affecter plusieurs processus, tels que la synthèse, la sécrétion, le transport, le métabolisme, ou l’action périphérique des hormones endogènes qui sont responsables du maintien de l’homéostasie, de la reproduction, du développement, et/ou du comportement de l’organisme. La liaison des récepteurs n’est pas le seul moyen d’action décrit jusqu’à présent pour les CED. Il est maintenant clair qu’ils peuvent également agir en recrutant des coactivateurs ou des corepresseurs dans des voies enzymatiques ou en modifiant des marqueurs épigénétiques déréglementant l’expression génique10,11,12,13 ,14, avec des conséquences non seulement pour la génération actuelle, mais aussi pour la santé des générations à venir8.
Hormones drosophiles
Les effets potentiels de certains CED ont été largement étudiés, tant chez les espèces sauvages que dans plusieurs systèmes modèles où les mécanismes endocriniens sont raisonnablement bien connus. Pour les invertébrés, les systèmes endocriniens qui influencent la croissance, le développement et la reproduction ont été largement caractérisés chez les insectes pour plusieurs raisons, impliquant leur utilisation étendue dans le domaine de la recherche biologique, leur importance économique, et enfin le développement d’insecticides capables d’interférer spécifiquement avec le système hormonal des insectes nuisibles.
En particulier, chez les insectes, la mouche des fruits D. melanogaster s’est avérée être un système modèle très puissant pour évaluer les effets endocriniens potentiels des SEE. Dans D. melanogaster, ainsi que chez les vertébrés, les hormones jouent un rôle important tout au long du cycle de vie. Dans cet organisme, il ya trois principaux systèmes hormonaux, qui impliquent l’hormone stéroïde 20-hydroxyecdysone (20E)15,16, l’hormone juvénile sesquiterpenoid (JH)17, et les neuropeptides et peptide / protéines hormones18. Ce troisième groupe se compose de plusieurs peptides découverts plus récemment mais clairement impliqués dans une grande variété de processus physiologiques et comportementaux, tels que la longévité, l’homéostasie, le métabolisme, la reproduction, la mémoire et le contrôle locomoteur. 20E est homologue aux hormones stéroïdes cholestérol-dérivées telles que l’estradiol, alors que JH partage quelques similitudes avec l’acide rétinoïque ; les deux sont les hormones les plus connues dans Drosophila19,20. Leur équilibre est essentiel dans la coordination de la mue et de la métamorphose, ainsi que dans le contrôle de plusieurs processus post-développementaux, tels que la reproduction, la durée de vie et le comportement21, offrant ainsi différentes possibilités pour tester le système endocrinien perturbation dans Drosophila. En outre, les hormones ecdysteroid et les JHsont les principales cibles des insecticides dits de troisième génération, développés pour interférer avec les processus développementaux et reproducteurs médiés par le système endocrinien chez les insectes. Le mode d’action agoniste ou antagoniste de ces produits chimiques est bien connu, et donc ils peuvent servir de normes de référence pour évaluer les effets des EDC potentiels sur la croissance, la reproduction et le développement des insectes22. Par exemple, la métahoprène, qui a été largement utilisée dans la lutte contre les moustiques et autres insectes aquatiques23,24, agit comme agoniste JH et réprime la transcription des gènes induite par 20E et la métamorphose.
En plus des hormones, la superfamille des récepteurs nucléaires (NR) dans Drosophila est également bien connue; il se compose de 18 facteurs de transcription évolutivement conservés impliqués dans le contrôle des voies de développement hormonales dépendantes, ainsi que la reproduction et la physiologie25. Ces NR d’hormone appartiennent à chacun des six sous-types de superfamille de NR, y compris ceux impliqués dans la neurotransmission26, deux pour l’acide rétinoïque NRs, et ceux pour les NRs stéroïdes qui, dans les vertébrés, représentent l’une des cibles primaires des EDCs27.
La drosophile comme système modèle d’étude des DEC
Actuellement, sur la base de propriétés moléculaires, plusieurs agences environnementales à travers le monde attribuent le potentiel d’interférer avec les systèmes endocriniens à différents produits chimiques d’origine humaine. Étant donné que les SEE constituent un problème mondial et omniprésent pour l’environnement et les organismes, l’objectif global de la recherche dans ce domaine est de réduire leur fardeau de morbidité et de protéger les organismes vivants contre leurs effets néfastes. Afin d’approfondir la compréhension des effets endocriniens potentiels d’un produit chimique, il est nécessaire de le tester in vivo. À cette fin, D. melanogaster représente un système de modèle valide. À ce jour, la mouche des fruits a été largement utilisée comme modèle in vivo pour évaluer les effets de plusieurs SEE environnementales; il a été signalé que l’exposition à plusieurs EDC, tels que le phtalate de dibutyle (DBP)28, bisphénol A (BPA), 4-nonylphénol (4-NP), 4-tert-octylphénol (4-tert-OP)29, methylparaben (MP)30, ethylparaben (EP)31, 32, bis-(2-éthylhexyl) phtalate (DEHP)33, et 17-ethinylestradiol (EE2)34, influence le métabolisme et les fonctions endocriniennes comme dans les modèles vertébrés. Plusieurs raisons ont conduit à son utilisation comme modèle dans ce domaine de recherche. Au-delà d’une excellente connaissance de ses systèmes endocriniens, d’autres avantages incluent son cycle de vie court, son faible coût, son génome facilement manipulable, une longue histoire de recherche et plusieurs possibilités techniques (voir le site Web flyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster fournit également un modèle puissant pour étudier facilement les effets transgénérationnels et les réponses des populations aux facteurs environnementaux8 et évite les questions éthiques pertinentes pour les études in vivo chez les animaux plus élevés. En outre, la mouche des fruits partage un degré élevé de conservation des gènes avec les humains, ce qui pourrait permettre à Drosophila EDC d’essayer de prédire ou de suggérer les effets potentiels de ces produits chimiques pour la santé humaine. En plus d’élargir la compréhension des effets sur la santé humaine, Drosophila peut aider à évaluer les risques d’exposition d’EDC à l’environnement, tels que la perte de biodiversité et la dégradation de l’environnement. Enfin, la mouche des fruits offre l’avantage supplémentaire d’être utilisée dans les laboratoires, où les facteurs susceptibles d’affecter son développement, sa reproduction et sa durée de vie peuvent être maîtrisés afin d’attribuer toute variation à la substance à tester.
Dans cet esprit, nous avons optimisé des tests de condition physique simples et robustes pour déterminer les effets d’EDC sur certains traits hormonaux Drosophila, tels que la fécondité/fertilité, le moment du développement et la durée de vie adulte. Ces essais ont été largement utilisés pour certains EDCs23,24,25,26,27. En particulier, nous avons utilisé les protocoles suivants pour évaluer les effets de l’exposition à l’oestrogène synthétique EE234 et au BPA et au bisphénol AF (BPA F) (données non publiées). Ces protocoles peuvent être facilement modifiés pour étudier les effets d’un EDC donné à la fois, ainsi que les effets combinés de plusieurs EDC dans D. melanogaster.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mouche des fruits D. melanogaster a été largement utilisé comme un système de modèle in vivo pour étudier les effets potentiels des EDC environnementales telles que DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33, et EE234. Plusieurs raisons ont conduit son utilisation comme modèle dans ce domaine de recherche. Outre se…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Orsolina Petillo pour son soutien technique. Les auteurs remercient le Dr Mariarosaria Aletta (CNR) pour son soutien bibliographique. Les auteurs remercient le Dr Gustavo Damiano Mita de les avoir introduits dans le monde d’EDC. Les auteurs remercient Leica Microsystems et Pasquale Romano pour leur aide. Cette recherche a été appuyée par le projet PON03PE-00110-1. “Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica” acronimo “SORRISO”; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Projet PO FESR Campania 2007-2013 “NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE”.
Materials
| 17α-Ethinylestradiol | Sigma | E4876-1G | |
| Agar for Drosophila medium | BIOSIGMA | 789148 | |
| Bisphenol A | Sigma | 239658-50G | |
| Bisphenol AF | Sigma | 90477-100MG | |
| Cornmeal | CA' BIANCA | ||
| Diethyl ether | Sigma | ||
| Drosophila Vials | BIOSIGMA | 789008 | 25×95 mm |
| Drosophila Vials | BIOSIGMA | 789009 | 29×95 mm |
| Drosophila Vials | Kaltek | 187 | 22X63 |
| Embryo collection cage | Crafts | Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying | |
| Ethanol | FLUKA | 2860 | |
| Etherizer | Crafts | cylindrical glass container with a cotton plug | |
| Glass Bottle | 250mL Bottles | ||
| Glass Vials | Microtech | ST 10024 | FLAT BOTTOM TUBE 100X24 |
| Hand blender Pimmy | Ariete | food processor | |
| Instant Success yeast | ESKA | Powdered yeast | |
| Laying tray | Crafts | plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying | |
| Methyl4-hydroxybenzoate | SIGMA | H5501 | |
| Petri Dish | Falcon | 351016 | 60×5 |
| Red dye no. 40 | SIGMA | 16035 | |
| Stereomicroscope with LED lights | Leica | S4E | |
| Sucrose | HIMEDIA | MB025 | |
| Tomato sauce | Cirio |
Riferimenti
- Kareiva, P. M., Marvier, M., Kareiva, P. M., Marvier, M. Managing fresh water for people and nature. Conservation Science: Balancing the Needs of People and Nature. , 460-509 (2011).
- Zoeller, R. T., et al. Endocrine-disrupting chemicals and public health protection: a statement of principles from The Endocrine Society. Endocrinology. 153 (9), 4097-4110 (2012).
- Guillette, J., Gunderson, M. P. Alterations in development of reproductive and endocrine systems of wildlife populations exposed to endocrine-disrupting contaminants. Reproduction. 122, 857-864 (2001).
- Guillette, L. J. Endocrine disrupting contaminants-beyond the dogma. Environmental Health Perspectives. 114, 9-12 (2006).
- Liao, C. S., Yen, J. H., Wang, Y. S. Growth inhibition in Chinese cabbage (Brassica rapa var. chinensis) growth exposed to di-n-butyl phthalate. Journal of Hazardous Materials. 163, 625-631 (2009).
- Qiu, Z., Wang, L., Zhou, Q. Effects of Bisphenol A on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence in above-ground organs of soybean seedlings. Chemosphere. 90, 1274-1280 (2013).
- Wang, S., et al. Effects of Bisphenol A, an environmental endocrine disruptor, on the endogenous hormones of plants. Environmental Science and Pollution Research. 22, 17653-17662 (2015).
- Quesada-Calderón, S., et al. The multigenerational effects of water contamination and endocrine disrupting chemicals on the fitness of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 7, 6519-6526 (2017).
- Bergman, A., Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. . The State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals – 2012. , (2013).
- Bachega, T. A. S. S., Verreschi, I. T., Frade, E. M. C., D’Abronzo, F. H., Lazaretti-Castro, M. The environmental endocrine disruptors must receive the attention of Brazilian endocrinologists. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 55, 175-176 (2011).
- Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 127, 204-215 (2011).
- Lee, S. B., Choi, J. Effects of Bisphenol A and Ethynyl estradiol exposure on enzyme activities, growth and development in the fourth instar larvae of Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 68, 84-90 (2007).
- Vos, J. G., et al. Health effects of endocrine-disrupting chemicals on wildlife, with special reference to the European situation. Critical Reviews in Toxicology. 20, 71-133 (2000).
- Costa, E. M. F., Spritzer, P. M., Hohl, A., Bachega, T. A. S. S. Effects of endocrine disruptors in the development of the female reproductive tract. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 58 (2), 153-161 (2014).
- Thummel, C. S. From embryogenesis to metamorphosis: the regulation and function of Drosophila nuclear receptor superfamily members. Cell. 83, 871-877 (1995).
- Schwedes, C. C., Carney, G. E. Ecdysone signaling in adult Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 58, 293-302 (2012).
- Flatt, T., Kawecki, T. J. Pleiotropic effects of methoprene-tolerant (Met), a gene involved in juvenile hormone metabolism, on life history traits in Drosophila melanogaster. Genetica. 122, 141-160 (2004).
- Nassel, D. R., Winther, A. M. E. Drosophila neuropeptides in regulation of physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 92, 42-104 (2010).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annual Review of Entomology. 47, 467-500 (2002).
- Gáliková, M., Klepsatel, P., Senti, G., Flatt, T. Steroid hormone regulation of C. elegans and Drosophila aging and life history. Experimental Gerontology. 46, 141-147 (2011).
- Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in Drosophila. Trends in Endocrinology & Metabolism. 11, 276-280 (2000).
- Weltje, L., Matthiessen, P. Techniques for Measuring Endocrine Disruption in Insects. Endocrine Disrupters: Hazard Testing and Assessment Methods. , 100-115 (2013).
- Zou, Z., et al. Juvenile hormone and its receptor, methoprene-tolerant, control the dynamics of mosquito gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), E2173-E2181 (2013).
- Zhao, W. L., et al. Methoprene-tolerant 1 regulates gene transcription to maintain insect larval status. Journal of Molecular Endocrinology. 53 (1), 93-104 (2014).
- Mangelsdorf, D. J., et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 83, 835-839 (1995).
- Riddiford, L. M., Bate, M., Martinez Arias, A. Hormones and Drosophila development. The Development of Drosophila melanogaster. , 899-939 (1993).
- Watts, M. M., Pascoe, D., Carroll, K. Chronic exposure to 17a-ethinylestradiol and bisphenol A-effects on development and reproduction in the freshwater invertebrate Chironomus riparius (Diptera: chironomidae). Aquatic Toxicology. 55, 113-124 (2001).
- Atli, E. The effects of dibutyl phthalate (DBP) on the development and fecundity of Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 93, 164-171 (2010).
- Atli, E. The effects of three selected endocrine disrupting chemicals on the fecundity of fruit fly, Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 9, 433-437 (2013).
- Gu, W., Xie, D. J., Hou, X. W. Toxicity and estrogen effects of methylparaben on Drosophila melanogaster. Food Science. 30, 252-254 (2009).
- Liu, T., Li, Y., Zhao, X., Zhang, M., Gu, W. Ethylparaben affects lifespan, fecundity, and the expression levels of ERR, EcR and YPR in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 71, 1-7 (2014).
- Chen, Q., Pan, C., Li, Y., Zhang, M., Gu, W. The Combined Effect of Methyl- and Ethyl-Paraben on Lifespan and Preadult Development Period of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 1-8 (2016).
- Cao, H., Wiemerslage, L., Marttila, P. S., Williams, M. J., Schioth, H. B. Bis-(2-ethylhexyl) Phthalate Increases Insulin Expression and Lipid Levels in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 119, 309-316 (2016).
- Bovier, T. F., Rossi, S., Mita, D. G., Digilio, F. A. Effects of the synthetic estrogen 17-α-ethinylestradiol on Drosophila T melanogaster: Dose and gender dependence. Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 625-632 (2018).
- Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147, 433-437 (1982).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and non- monotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33, 378-455 (2012).
- Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Mini Review: Drosophila melanogaster as a Promising Model Organism in Toxicological Studies. Archives of Basic and Applied. 1, 33-38 (2013).
- Yesilada, E. Genotoxic Activity of Vinasse and Its Effect on Fecundity and Longevity of Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 63, 560-566 (1999).
- Atli, E., Ünlü, H. The effects of microwave frequency electromagnetic fields on the fecundity of Drosophila melanogaster. Turkish Journal of Biology. 31, 1-5 (2007).
- Flatt, T., Tu, M., Tatar, M. Hormonal pleiotropy and the juvenile hormone regulation of Drosophila development and life history. BioEssays. 27, 999-1010 (2005).
- Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental Toxicity Assays Using the Drosophila Model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1-27 (2015).
- Fletcher, J. C., Burtis, K. C., Hogness, D. S., Thummel, C. S. The Drosophila E74 gene is required for metamorphosis and plays a role in the polytene chromosome puffing response to ecdysone. Development. 121, 1455-1465 (1995).
- Giordano, E., Peluso, I., Senger, S., Furia, M. minifly, A Drosophila Gene Required for Ribosome Biogenesis. The Journal of Cell Biology. 144 (6), 1123-1133 (1999).
- Tower, J., Arbeitman, M. The genetics of gender and life span. The Journal of Biology. 8, 38 (2009).
- Digilio, F. A., et al. Quality-based model for Life Sciences research guidelines. Accreditation and Quality Assurance. 21, 221-230 (2016).
- Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. Journal of Insect Physiology. 47, 1301-1307 (2001).
- Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (71), e50068 (2013).
- Weltje He, Y., Jasper, H. Studying aging in Drosophila. Methods. 68, 129-133 (2014).
