JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia dello sviluppo

Методы тестирования эндокринных нарушений в Drosophila меланогастер

Published: July 03, 2019
doi:
10.3791/59535
, , , , ,
1Institute of Biosciences and BioResources,National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET),National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology,UniNa “Federico II”

Summary

Химические вещества эндокринного разрушителя (ЭДЦ) представляют собой серьезную проблему для организмов и природной среды. Drosophila melanogaster представляет собой идеальную модель для изучения эффектов EDC in vivo. Здесь мы представляем методы для исследования эндокринных нарушений в Drosophila, обращаясь EDC эффекты на плодовитость, плодовитость, время развития, и продолжительность жизни мухи.

Abstract

В последние годы растет доказательств того, что все организмы и окружающая среда подвергаются воздействию гормоноподобных химических веществ, известных как эндокринные химические вещества-разрушители (ЭДК). Эти химические вещества могут изменить нормальный баланс эндокринной системы и привести к неблагоприятным последствиям, а также увеличение числа гормональных нарушений в популяции человека или нарушенного роста и сокращения воспроизводства в дикой природе видов. Для некоторых ЭДЦ существуют документально подтвержденные последствия для здоровья и ограничения на их использование. Однако для большинства из них до сих пор нет научных доказательств в этом смысле. Для того, чтобы проверить потенциальное эндокринное воздействие химического вещества в полном организме, мы должны проверить его в соответствующих модельных системах, а также в плодовой мухи, Drosophila melanogaster. Здесь мы сообщаем подробные протоколы in vivo для изучения эндокринных нарушений в Drosophila, обращаясь edC эффекты на плодовитость / фертильность, сроки развития, и продолжительность жизни мухи. В последние несколько лет, мы использовали эти черты жизни дрозофилы для расследования последствий воздействия 17-й-этинилэстрадиол (EE2), бисфенол А (BPA), и бисфенол AF (BPA F). В общей сложности, эти анализы охватывает все этапы жизни Drosophila и позволило оценить эндокринные нарушения во всех гормоно-опосредованных процессов. Анализы сроков плодородия/фертильности и развития были полезны для измерения воздействия EDC на репродуктивную производительность мух и на этапы развития, соответственно. Наконец, продолжительность жизни с участием хронических воздействия EDC взрослых и измеряется их выживаемости. Тем не менее, эти жизненные черты также могут зависеть от нескольких экспериментальных факторов, которые должны были быть тщательно контролируется. Итак, в этой работе мы предлагаем ряд процедур, которые мы оптимизировали для правильного результата этих анализов. Эти методы позволяют ученым установить эндокринные нарушения для любого EDC или для смеси различных EDCs в Drosophila, хотя для определения эндокринного механизма, ответственного за эффект, дальнейшие эссе могут быть необходимы.

Introduction

Деятельность человека высвобождает в окружающую среду огромное количество химических веществ, которые представляют собой серьезную проблему для организмов и для природных экосистем1. Из этих загрязнителей, по оценкам, около 1000 различных химических веществ могут изменить нормальный баланс эндокринной системы; в соответствии с этим свойством, они классифицируются как эндокринные разрушающие химические вещества (EDCs). В частности, на основе недавнего определения Эндокринного общества, EDCs являются “экзогенным химическим веществом, или смесь химических веществ, которые могут вмешиваться в любой аспект гормонального действия”2. За последние три десятилетия, наблюдается рост научных доказательств того, что EDCs может повлиять на воспроизводство и развитие животных и растений3,4,5,6,7, 8. Кроме того, воздействие EDC было связано с ростом распространенности некоторых заболеваний человека, включая рак, ожирение, диабет, заболевания щитовидной железы, и поведенческие расстройства9,10,11.

Общие механизмы EDC

Из-за своих молекулярных свойств, EDCs ведут себякак гормоны или прекурсоры гормонов 3,4,5,6,8,9, 10,11,12. В этом смысле они могут связываться с рецептором гормона и нарушать эндокринную систему либо, имитируя активность гормонов, либо блокируя эндогенные гормоны, связывающие. В первом случае, после связывания с рецептором, они могут активировать его, как его естественный гормон будет делать. В другом случае, связывание EDC с рецептором предотвращает связывание его естественного гормона, поэтому рецептор блокируется и больше не может быть активирован, даже при наличии его естественного гормона3. Как следствие, EDCs может повлиять на несколько процессов, таких как синтез, секреция, транспорт, метаболизм, или периферийное действие эндогенных гормонов, которые отвечают за поддержание гомеостаза, размножения, развития и / или поведение организма. Связывание рецепторов не является единственным способом действия, описанным до сих пор для EDCs. Теперь ясно, что они также могут действовать путем набора коактиваторов или основных сепрессоров в ферментативных путей или путем изменения эпигенетических маркеров дерегулирования экспрессии генов10,11,12,13 ,14, с последствиями не только для нынешнего поколения, но и для здоровья грядущих поколений8.

Гормоны дрозофилы

Потенциальные последствия отдельных ЭДЦ были широко изучены, как в видах дикой природы, так и в нескольких модельных системах, в которых достаточно хорошо известны эндокринные механизмы. Для беспозвоночных эндокринные системы, влияющие на рост, развитие и размножение, широко охарактеризованы насекомыми по нескольким причинам, включая их широкое использование в области биологических исследований, их экономическое значение и наконец, развитие инсектицидов в состоянии вмешиваться конкретно в гормональную систему насекомых-вредителей.

В частности, среди насекомых плодовая муха D. melanogaster оказалась очень мощной модельной системой для оценки потенциальных эндокринных эффектов ЭДЦ. В D. melanogaster, как и у позвоночных, гормоны играют важную роль на протяжении всего жизненного цикла. В этом организме, Есть три основные гормональные системы, которые включают стероидных гормонов 20-гидроксиексидизон (20E)15,16, сесквитерпеноид ювенильный гормон (JH)17, и нейропептидов и пептида / белка гормоны18. Эта третья группа состоит из нескольких пептидов, обнаруженных совсем недавно, но явно участвующих в огромном разнообразии физиологических и поведенческих процессов, таких как долголетие, гомеостаз, обмен веществ, воспроизводство, память, и локомотив ный контроль. 20E является гомологичным для холестерина полученных стероидных гормонов, таких как эстрадиол, в то время как JH разделяет некоторые сходства с ретинойной кислоты; оба они являются наиболее известными гормонами в Drosophila19,20. Их баланс имеет жизненно важное значение в координации линьки и метаморфозы, а также в управлении несколькими постразвития процессов, таких как воспроизводство, продолжительность жизни, и поведение21, таким образом, предлагая различные возможности для тестирования эндокринной нарушения в Дрозофиле. Кроме того, экристероидные гормоны и JH являются основными целями так называемых инсектицидов третьего поколения, разработанных для вмешательства в процессы развития и репродуктивного эндокринных опосредованных у насекомых. Агонист или антагонист режим действия этих химических веществ хорошо известен, и, таким образом, они могут служить в качестве эталонных стандартов для оценки влияния потенциальных EDCs на рост, размножение и развитие насекомых22. Например, метопрена, которая широко используется в борьбе с комарами и другими водными насекомыми23,24, работает как агонист JH и подавляет 20E-индуцированной транскрипции генов и метаморфоз.

В дополнение к гормонам, суперсемейка ядерных рецепторов (NR) в Дрозофиле также хорошо известна; она состоит из 18 эволюционно сохраненных транскрипционных факторов, участвующих в контроле гормонозависимых путей развития, а также воспроизводства и физиологии25. Эти гормоны НР принадлежат ко всем шести NR суперсемейных подтипов, в том числе тех, кто участвует в нейротрансмиссии26, два для ретинойной кислоты НР, и те, для стероидных НР, которые, у позвоночных, представляют собой одну из основных целей EDCs27.

Дрозофила как модельная система для изучения EDCs

В настоящее время, исходя из молекулярных свойств, несколько природоохранных учреждений во всем мире объясняют возможность вмешательства в эндокринные системы различными антропогенными химическими веществами. С учетом того, что ЭЦП представляют собой глобальную и повсеместную проблему для окружающей среды и организмов, общая цель исследований в этой области заключается в сокращении бремени их болезней, а также в защите живых организмов от их неблагоприятных последствий. Для того, чтобы углубить понимание о потенциальном эндокринных эффектов химического вещества, необходимо проверить его in vivo. С этой целью D. melanogaster представляет собой действительную модельную систему. До настоящего времени плодовая муха широко использовалась в качестве модели in vivo для оценки воздействия нескольких экологических ЭДЦ; было сообщено, что воздействие нескольких EDCs, таких как дибутил фталат (DBP)28, бисфенол A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-терт-октильфенол (4-терт-OP)29, метилпарабен (MP)30, этилпарабен (EP)31, 32, бис-(2-этилгексил) фталат (DEHP)33,и 17-з-этинилэстрадиол (EE2)34, влияет на обмен веществ и эндокринные функции, как в позвоночных моделей. Несколько причин привели к его использованию в качестве модели в этой области исследований. Помимо превосходного знания его эндокринной системы, дальнейшие преимущества включают в себя его короткий жизненный цикл, низкая стоимость, легко манипулируемый геном, долгая история исследований, и несколько технических возможностей (см. сайт FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster также обеспечивает мощную модель для легкого изучения эффектов трансгенерации и реакции населения на факторы окружающей среды8 и позволяет избежать этических вопросов, имеющих отношение к исследованиям in vivo у высших животных. Кроме того, плодовая муха разделяет высокую степень сохранения генов с людьми, которые могли бы сделать возможным для Drosophila EDC анализы, чтобы помочь в прогнозировании или предлагая потенциальные последствия этих химических веществ для здоровья человека. Помимо расширения понимания последствий для здоровья человека, Дрозофила может помочь оценить риски воздействия ЭДК на окружающую среду, такие как утрата биоразнообразия и ухудшение состояния окружающей среды. Наконец, плодовая муха предлагает дополнительное преимущество использования в лабораториях, где факторы, потенциально влияющие на ее развитие, размножение и продолжительность жизни, могут быть под контролем, с тем чтобы отнести любые изменения к веществу, которое должно быть проверено.

Имея это в виду, мы оптимизировали простые и надежные фитнес-анализы для определения эффектов EDC на некоторые причинно-то гормональные черты, такие как плодовитость/фертильность, время развития и продолжительность взрослой жизни. Эти анализы были широко использованы для некоторых EDCs23,24,25,26,27. В частности, мы использовали следующие протоколы для оценки воздействия синтетического эстрогена EE234 и BPA и бисфенола AF (BPA F) (неопубликованные данные). Эти протоколы могут быть легко изменены для изучения последствий данной EDC в то время, а также комбинированные эффекты нескольких EDCs в D. melanogaster.

Protocol

1. Приготовление пищи Для поддержания запасов и для роста личинок, используйте среду кукурузной муки, содержащую 3 % порошкообразных дрожжей, 10 % сахарозы, 9 % предварительно приготовленную кукурузную муку, 0,4 % агара, после чего называется Cornmeal medium (CM). Положите 30 г дрожж…

Representative Results

В этом разделе основные шаги вышеуказанных протоколов сообщаются в виде упрощенных схем. Учитывая, что мухи, как правило, чтобы избежать неприятных соединений, первое, что нужно сделать, это, чтобы рассказать вкус выбранного EDC. Это можно сделать путем смешивания пищевой краситель (напр?…

Discussion

Плодовая муха D. melanogaster широко используется в качестве модели системы in vivo для изучения потенциальных последствий экологических EDC, таких как DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33, и EE234. Нескол…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Орсолину Петильо за техническую поддержку. Авторы благодарят доктора Марианасорию Алетту (CNR) за библиографическую поддержку. Авторы благодарят д-ра Густаво Дамиано Миту за то, что он познакомил их с миром EDC. Авторы благодарят Leica Microsystems и Pasquale Romano за помощь. Это исследование было поддержано проектом PON03PE-00110-1. “Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica” acronimo “SORRISO”; Комманент: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Проект PO FESR Campania 2007-2013 “NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NanoTECNOLOGIE”.

Materials

17α-Ethinylestradiol Sigma E4876-1G
Agar for Drosophila medium BIOSIGMA 789148
Bisphenol A Sigma 239658-50G
Bisphenol AF Sigma 90477-100MG
Cornmeal CA' BIANCA
Diethyl ether Sigma
Drosophila Vials BIOSIGMA 789008 25×95 mm
Drosophila Vials BIOSIGMA 789009 29×95 mm
Drosophila Vials Kaltek 187 22X63
Embryo collection cage Crafts Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol FLUKA 2860
Etherizer Crafts cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle 250mL Bottles
Glass Vials Microtech ST 10024 FLAT BOTTOM TUBE 100X24
Hand blender Pimmy Ariete food processor
Instant Success yeast ESKA Powdered yeast
Laying tray Crafts plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate SIGMA H5501
Petri Dish Falcon 351016 60×5
Red dye no. 40 SIGMA 16035
Stereomicroscope with LED lights Leica S4E
Sucrose HIMEDIA MB025
Tomato sauce Cirio
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Kareiva, P. M., Marvier, M., Kareiva, P. M., Marvier, M. Managing fresh water for people and nature. Conservation Science: Balancing the Needs of People and Nature. , 460-509 (2011).
  2. Zoeller, R. T., et al. Endocrine-disrupting chemicals and public health protection: a statement of principles from The Endocrine Society. Endocrinology. 153 (9), 4097-4110 (2012).
  3. Guillette, J., Gunderson, M. P. Alterations in development of reproductive and endocrine systems of wildlife populations exposed to endocrine-disrupting contaminants. Reproduction. 122, 857-864 (2001).
  4. Guillette, L. J. Endocrine disrupting contaminants-beyond the dogma. Environmental Health Perspectives. 114, 9-12 (2006).
  5. Liao, C. S., Yen, J. H., Wang, Y. S. Growth inhibition in Chinese cabbage (Brassica rapa var. chinensis) growth exposed to di-n-butyl phthalate. Journal of Hazardous Materials. 163, 625-631 (2009).
  6. Qiu, Z., Wang, L., Zhou, Q. Effects of Bisphenol A on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence in above-ground organs of soybean seedlings. Chemosphere. 90, 1274-1280 (2013).
  7. Wang, S., et al. Effects of Bisphenol A, an environmental endocrine disruptor, on the endogenous hormones of plants. Environmental Science and Pollution Research. 22, 17653-17662 (2015).
  8. Quesada-Calderón, S., et al. The multigenerational effects of water contamination and endocrine disrupting chemicals on the fitness of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 7, 6519-6526 (2017).
  9. Bergman, A., Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. . The State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals – 2012. , (2013).
  10. Bachega, T. A. S. S., Verreschi, I. T., Frade, E. M. C., D’Abronzo, F. H., Lazaretti-Castro, M. The environmental endocrine disruptors must receive the attention of Brazilian endocrinologists. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 55, 175-176 (2011).
  11. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 127, 204-215 (2011).
  12. Lee, S. B., Choi, J. Effects of Bisphenol A and Ethynyl estradiol exposure on enzyme activities, growth and development in the fourth instar larvae of Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 68, 84-90 (2007).
  13. Vos, J. G., et al. Health effects of endocrine-disrupting chemicals on wildlife, with special reference to the European situation. Critical Reviews in Toxicology. 20, 71-133 (2000).
  14. Costa, E. M. F., Spritzer, P. M., Hohl, A., Bachega, T. A. S. S. Effects of endocrine disruptors in the development of the female reproductive tract. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 58 (2), 153-161 (2014).
  15. Thummel, C. S. From embryogenesis to metamorphosis: the regulation and function of Drosophila nuclear receptor superfamily members. Cell. 83, 871-877 (1995).
  16. Schwedes, C. C., Carney, G. E. Ecdysone signaling in adult Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 58, 293-302 (2012).
  17. Flatt, T., Kawecki, T. J. Pleiotropic effects of methoprene-tolerant (Met), a gene involved in juvenile hormone metabolism, on life history traits in Drosophila melanogaster. Genetica. 122, 141-160 (2004).
  18. Nassel, D. R., Winther, A. M. E. Drosophila neuropeptides in regulation of physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 92, 42-104 (2010).
  19. Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annual Review of Entomology. 47, 467-500 (2002).
  20. Gáliková, M., Klepsatel, P., Senti, G., Flatt, T. Steroid hormone regulation of C. elegans and Drosophila aging and life history. Experimental Gerontology. 46, 141-147 (2011).
  21. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in Drosophila. Trends in Endocrinology & Metabolism. 11, 276-280 (2000).
  22. Weltje, L., Matthiessen, P. Techniques for Measuring Endocrine Disruption in Insects. Endocrine Disrupters: Hazard Testing and Assessment Methods. , 100-115 (2013).
  23. Zou, Z., et al. Juvenile hormone and its receptor, methoprene-tolerant, control the dynamics of mosquito gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), E2173-E2181 (2013).
  24. Zhao, W. L., et al. Methoprene-tolerant 1 regulates gene transcription to maintain insect larval status. Journal of Molecular Endocrinology. 53 (1), 93-104 (2014).
  25. Mangelsdorf, D. J., et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 83, 835-839 (1995).
  26. Riddiford, L. M., Bate, M., Martinez Arias, A. Hormones and Drosophila development. The Development of Drosophila melanogaster. , 899-939 (1993).
  27. Watts, M. M., Pascoe, D., Carroll, K. Chronic exposure to 17a-ethinylestradiol and bisphenol A-effects on development and reproduction in the freshwater invertebrate Chironomus riparius (Diptera: chironomidae). Aquatic Toxicology. 55, 113-124 (2001).
  28. Atli, E. The effects of dibutyl phthalate (DBP) on the development and fecundity of Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 93, 164-171 (2010).
  29. Atli, E. The effects of three selected endocrine disrupting chemicals on the fecundity of fruit fly, Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 9, 433-437 (2013).
  30. Gu, W., Xie, D. J., Hou, X. W. Toxicity and estrogen effects of methylparaben on Drosophila melanogaster. Food Science. 30, 252-254 (2009).
  31. Liu, T., Li, Y., Zhao, X., Zhang, M., Gu, W. Ethylparaben affects lifespan, fecundity, and the expression levels of ERR, EcR and YPR in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 71, 1-7 (2014).
  32. Chen, Q., Pan, C., Li, Y., Zhang, M., Gu, W. The Combined Effect of Methyl- and Ethyl-Paraben on Lifespan and Preadult Development Period of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 1-8 (2016).
  33. Cao, H., Wiemerslage, L., Marttila, P. S., Williams, M. J., Schioth, H. B. Bis-(2-ethylhexyl) Phthalate Increases Insulin Expression and Lipid Levels in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 119, 309-316 (2016).
  34. Bovier, T. F., Rossi, S., Mita, D. G., Digilio, F. A. Effects of the synthetic estrogen 17-α-ethinylestradiol on Drosophila T melanogaster: Dose and gender dependence. Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 625-632 (2018).
  35. Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147, 433-437 (1982).
  36. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and non- monotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33, 378-455 (2012).
  37. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Mini Review: Drosophila melanogaster as a Promising Model Organism in Toxicological Studies. Archives of Basic and Applied. 1, 33-38 (2013).
  38. Yesilada, E. Genotoxic Activity of Vinasse and Its Effect on Fecundity and Longevity of Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 63, 560-566 (1999).
  39. Atli, E., Ünlü, H. The effects of microwave frequency electromagnetic fields on the fecundity of Drosophila melanogaster. Turkish Journal of Biology. 31, 1-5 (2007).
  40. Flatt, T., Tu, M., Tatar, M. Hormonal pleiotropy and the juvenile hormone regulation of Drosophila development and life history. BioEssays. 27, 999-1010 (2005).
  41. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental Toxicity Assays Using the Drosophila Model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1-27 (2015).
  42. Fletcher, J. C., Burtis, K. C., Hogness, D. S., Thummel, C. S. The Drosophila E74 gene is required for metamorphosis and plays a role in the polytene chromosome puffing response to ecdysone. Development. 121, 1455-1465 (1995).
  43. Giordano, E., Peluso, I., Senger, S., Furia, M. minifly, A Drosophila Gene Required for Ribosome Biogenesis. The Journal of Cell Biology. 144 (6), 1123-1133 (1999).
  44. Tower, J., Arbeitman, M. The genetics of gender and life span. The Journal of Biology. 8, 38 (2009).
  45. Digilio, F. A., et al. Quality-based model for Life Sciences research guidelines. Accreditation and Quality Assurance. 21, 221-230 (2016).
  46. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. Journal of Insect Physiology. 47, 1301-1307 (2001).
  47. Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (71), e50068 (2013).
  48. Weltje He, Y., Jasper, H. Studying aging in Drosophila. Methods. 68, 129-133 (2014).

Tags

Drosophila MelanogasterEndocrine DisruptionFertilityDevelopmentLifespanEndocrine DisruptorsIn VivoReproductive PerformanceCornmeal MediumEE2Carbon Dioxide

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Bovier, T. F., Cavaliere, D., Colombo, M., Peluso, G., Giordano, E., Digilio, F. A. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59535, doi:10.3791/59535 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image