Шутвард движение CFDA трассировщика загружается в нижней раковина ткани арабидопсис
Summary
Цель этого протокола заключается в том, чтобы показать, как загрузить CFDA на различные участки нижней части Арабиопсис. Затем мы представляем результирующий шаблон распределения CF в побегах.
Abstract
Симпластический трассировщик 5 (6)-carboxyfeceв диацетат (КФДА) широко применяется в живых растениях, чтобы продемонстрировать межклеточные связи, флоэмы транспорта и сосудистой паттерн. Этот протокол показывает движение снизу к началу карбоксефлюфторисеин (CF) движения в арабидопсис , используя корень-резки и гипокотиля-щипать процедуры соответственно. Эти две различные процедуры приводят к различной эффективности движения CF: около 91% появление CF в побеги с гипокотиля-щипать процедуру, в то время как только около 70% появление CF с корневой процедурой. Простое изменение загрузочных участков, приводящее к существенным изменениям в мобильной эффективности этого симпластикового красителя, предполагает, что движение CF может подлежать симпластическому регулированию, скорее всего, на основе корневого-гипокотилового соединения.
Introduction
Многие флуоресцентные индикаторы с диапазоном спектральных свойств, таких как 5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1, 8-гидроксипирен-1, 3, 6-трисульфонная кислота2, ЛЮЦИФЕР желтый CH (lych)3, esculin и cter4, были разработаны и применяется в растениях для контроля за симпластическим движением и активностью флоема. Как правило, симпластмассовый краситель загружается в разрез в целевой ткани и последовательное рассеивание репортера в другие части растения продемонстрирует межклеточные связи. Хотя механизм поглощения красителя до конца не изучен, широко признается принцип, лежащий в основе движения CF внутри живых клеток. Эстер форме CF (CF диацетат, CFDA) не флуоресцентные, но мембраны проницаемой. Это свойство позволяет быстрое распространение мембраны красителя в клетки. Оказавшись внутри живые клетки, внутриклеточные эстеразы удалить ацетат групп на 3 ‘ и 6 ‘ положение CFDA, выпуская флуоресцентные и мембранно-непроницаемой CF (рис. 1, в качестве альтернативы относятся Райт et al.2); CF может после этого двинуть через плазмодесмами к другим частям заводов.
Хорошо налаженная процедура с CFDA является то, что он может быть загружен в исходный лист и используется для мониторинга флоэмы потокового и флоэмы разгрузки в тканях раковины многих видов, например, как разгрузка CF в корень арабидопсис 5, флоэмы разгрузки во время картофельной бугорка6, флоэмы разгрузки в никотиана раковина листья7, и так далее. Подобными погрузочные подходы, другие исследования приняли этот краситель, чтобы продемонстрировать симпластическую связь между хозяином и паразитами8,9, или выявить симбиотические отношения10,11.
Еще один способ сделать использование этого красителя является загрузка его в конкретных ячеек или одной ячейки путем микроинъекции, чтобы определить его структуру распределения. Такие сложные методы значительно облегчили наше более глубокое понимание плазмодесмами-опосредованной межклеточной коммуникации, особенно в развитии концепции симпластикового домена12,13. Например, Микроинъекция КФДА в котиледонские клетки арабидопсис привела к появлению красителя-сцепления в гипокотилном эпидермисе, но неувязке в базовых клетках или в корневых эпидермисе, поэтому гипокотиловый эпидермис образует симпластический домен14. Похожие домены, такие как устьиные клетки охраны15, сито элемент-компаньон клетки16, корень волосяных клеток14 и корень крышка17,18 были определены методом микроинъекций. Самое удивительное, некоторые домены позволяют трассирующими молекулам двигаться в определенном направлении. Возьмите трихоме домена, например, микроинъекции флуоресцентного зонда в поддерживающей эпидермального ячейки приводит к потоку трассирующими в домен трихома, однако, обратная инъекция не держит true19. В недавнем отчете также обнаружены аналогичные ситуации в симпластичных доменам20– и эмбрионов седума. Таким образом, все вышеперечисленные случаи подразумевают, что замена загрузочных участков может привести к новым озарению в симпластическую коммуникацию. Наш предыдущий эксперимент, направленный на рассечения маршрута от корня до стрелять мобильных глушителей определили Роман симпластический домен, или HEJ (гипокотиля-эпиотилового соединения) зона, которая была дополнительно проверена через корневой нагрузки (неканонической мойки нагрузки) CFDA эксперимент21. Здесь, мы далее разрабатывать корень-к-стрелять CF движение с помощью простого метода и восстановить потенциальную симпластмассовый домен путем переноса загрузки сайтов. Кроме того, эта процедура может быть адаптирована для различения генетических фонов, которые изменили корень-к-стрелять междугородной.
Protocol
Representative Results
Discussion
Новые исследования показали, что растения могут быстро реагировать на внешние раздражители23, в том числе манипуляции, введенные в экспериментальных процедур22. В нашем первоначальном эксперименте, наш надзор за этими знаниями часто приводит к окрашиванию неу?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась национальным фондом естественных наук Китая (31671257) и Хубэй совместный инновационный центр для зерновой промышленности (LXT-16-18).
Materials
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade | |
References
- Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
- Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
- Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
- Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
- Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
- Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
- Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
- Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
- Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
- Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
- Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
- Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
- Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
- Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
- van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
- Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
- Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
- Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
- Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
- Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
- Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
- Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
- Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?. Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).
