שירי תנועה של CFDA מעקב טעון ברקמות הכיור התחתון של Arabidopsis
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד לטעון את ה-CFDA לאתרים שונים של החלקים התחתונים של Arabidopsis. לאחר מכן אנו מציגים את דפוס ההתפלגות שהתקבל של CF ב נצרי.
Abstract
מעקב אחר באופן סימטרי 5 (6)-carboxyפלואורוסקופים diacetate (cfda) כבר הוחל באופן נרחב בצמחים חיים כדי להדגים את החיבור התרבות, התחבורה שיפה ובדיקה כלי הדם. פרוטוקול זה מציג את החלק התחתון למעלה carboxyfluorescein (CF) תנועה ב Arabidopsis באמצעות חיתוך השורש ואת הליך ההיפוקטיל-צובט בהתאמה. אלה שני הליכים שונים התוצאה יעילות שונה של התנועה CF: כ 91% המראה של CF ב נצרי עם הליך ההיפוטיל-צובט, ואילו רק כ 70% המראה של CF עם הליך גזירה השורש. שינוי פשוט של אתרי טעינה, וכתוצאה מכך שינויים משמעותיים ביעילות הניידת של צבע זה באופן סימטרי, מציע התנועה CF עשוי להיות כפוף לתקנה באופן סימטרי, כנראה על ידי צומת השורש-היפוטיל.
Introduction
מכוניות פלורסנט רבים עם מגוון רחב של תכונות ספקטרליות, כגון 5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1, 8-הhydroxypyrene-1, 3, 6-חומצה טריגופרתית2, לוציפר צהוב CH (lych)3, esculin ו-cter4, פותחו ו מוחל בצמחים כדי לפקח על התנועה באופן סימטרי ופעילות שיפה. באופן כללי, צבע סימטרי מוטען לחתוך ברקמת היעד ואת הפיזור רציפים של הכתב לתוך חלקים אחרים של הצמח יהיה להדגים את התקשורת הבין-תאית. למרות המנגנון של ספיגת הצבע אינו מובן במלואו, העיקרון הבסיסי התנועה CF בתוך תאים חיים כבר הודה נרחב. הצורה אסתר של CF (CF diacetate, CFDA) הוא לא פלורסנט, אבל ממברנה חדיר. מאפיין זה מאפשר דיפוזיה הממברנה המהירה של הצבע לתאים. פעם בתוך תאים חיים, תאיים מוחק להסיר את הקבוצות אצטט ב 3 ‘ ו 6 ‘ מיקום של CFDA, שחרור פלורסנט ו-הממברנה ממברנה-CF (איור 1, לחילופין להפנות את רייט et al.2); CF לאחר מכן יכול לעבור דרך פלמודסמאטה לחלקים אחרים של צמחים.
הליך מבוסס היטב עם cfda הוא שזה יכול להיות טעון לתוך עלי מקור ומשמש כדי לפקח על הזרמת שיפה ו לפרוק שיפה ברקמות הכיור של מינים רבים, למשל, כמו הפריקה CF ב arabidopsis שורש5, לפרוק שיפה במהלך לקות תפוחי אדמה6, הפריקה שיפה ב טבק כיור עוזב7, וכן הלאה. לפי גישות העמסה דומות, אימצו מחקרים אחרים את הצבע כדי להדגים את הקשר הסימטרי בין הפונדקאי לטפיל8,9, או כדי לחשוף את יחסי הסימביוזה10,11.
דרך נוספת לעשות שימוש בצבע זה היא לטעון אותו לתוך תאים ספציפיים או תא בודד על-ידי הזרקה כדי לקבוע את דפוס ההפצה שלה. טכניקות מתוחכמות כאלה הקלו מאוד את ההבנה העמוקה יותר של התקשורת הבינתאית בתחום הפלסטימאטה, בעיקר בפיתוח הקונספט של הדומיין הסימטרי12,13. לדוגמה, המיקרו ההזרקה של CFDA לתוך תאים cotyledon של Arabidopsis הביא דפוס צימוד לצבוע באפידרמיס היפוקטיל אבל לא צימוד בתאים הבסיסיים או באפידרמיס השורש, ולכן ההיפוטיל היפוקתא צורות האפידרמיס בתחום הפלסטיק הסימטרי14. תחומים דומים, כגון התאים לשמירה על שיניים15, מסננת הגוף תאים16, שיער בתאי השורש14 וכיפה שורש17,18 זוהו על ידי טכניקה microinjection. באופן מפתיע, מספר תחומים מאפשרים למולקולות מעקב לנוע בכיוון מסוים. קח את התחום יונקת למשל, מיקרוהזרקה של בדיקה פלורסנט לתוך התא באפידרמיס התומך מוביל את זרימת מעקב לתוך התחום יונקת, עם זאת, הזרקת הפוכה אינה מחזיקה true19. הדו ח האחרון מצא גם מצבים דומים בתחומים סימטרי של העובר Sedum 20. כך, כל המקרים לעיל לרמוז כי החלפת אתרי טעינה עלול להוביל תובנות הרומן לתוך תקשורת סימטרית. הניסוי הקודם שלנו במטרה לנתח את המסלול של שורש לירות נייד להשתקה זיהה תחום הרומן סימטרי, או HEJ (היפוקטיל צומת אפיטיל) אזור, אשר נבדק עוד באמצעות טעינת השורש (לא קאנוני כיור הטעינה) CFDA . ניסוי21 כאן, אנו עוד להרחיב את התנועה שורש-to-לירות CF באמצעות שיטה פשוטה לשחזר את תחום הפוטנציאל סימטרי פלסטיק על ידי העברת אתרי הטעינה. יתר על כן, הליך זה עשוי להיות מותאם כדי להבדיל את הרקע הגנטי, כי יש שינוי בסיס לירות הובלה ארוכת טווח.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים מתעוררים הראו כי הצמחים יכולים להגיב במהירות לגירויים חיצוניים23, כולל מניפולציה הציג את ההליכים הניסיוניים22. בניסוי הראשוני שלנו, הפיקוח שלנו על ידע זה מוביל לעיתים קרובות להצביעת הכישלון. עם שיעורים אלה, אנו מציעים כי אמצעי הזהירות הבאים יש לזכור בעת ביצ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31671257) ו חוביי המרכז חדשנות שיתופית לתעשיית הדגן (LXT-16-18).
Materials
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade | |
References
- Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
- Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
- Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
- Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
- Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
- Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
- Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
- Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
- Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
- Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
- Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
- Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
- Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
- Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
- van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
- Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
- Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
- Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
- Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
- Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
- Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
- Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
- Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?. Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).
