Mouvement de la fusillade du traceur CFDA chargé dans les tissus de l’évier inférieur de l' Arabidopsis
Summary
Le but de ce protocole est de montrer comment charger la CFDA dans différents sites des parties inférieures de l’ Arabidopsis. Nous présentons ensuite le modèle de distribution de CF dans les pousses.
Abstract
Le traceur symplastique 5 (6)-carboxyfluorescéine diacétate (CFDA) a été largement appliqué dans les plantes vivantes pour démontrer la connexion intercellulaire, le transport de phloème et le modelage vasculaire. Ce protocole montre le mouvement de la carboxyfluorescéine de bas en haut (CF) dans l’ Arabidopsis à l’aide de la procédure de découpage des racines et de l’hypocotyle-pincement respectivement. Ces deux procédures différentes résultent en différentes efficacités du mouvement des FC: environ 91% de l’apparition de CF dans les pousses avec la procédure d’hypocotyle-pincement, alors que seulement environ 70% de l’apparition de CF avec la procédure de coupe des racines. Le simple changement des sites de chargement, entraînant des changements significatifs dans l’efficacité mobile de ce colorant symplastique, suggère que le mouvement des FC pourrait être soumis à la régulation symplasique, probablement par la jonction racine-hypocotyle.
Introduction
De nombreux traceurs fluorescents avec une gamme de propriétés spectrales, comme l’acide 5 (6)-carboxyfluorescéine (CF) 1,8-hydroxypyrène-1, 3, 6-trisulphonique2, Lucifer Yellow ch (Lych)3, esculine et cter4, ont été développés et appliqué dans les plantes pour surveiller le mouvement symplastique et l’activité de phloème. En général, un colorant symplastique est chargé dans une coupe dans le tissu cible et la dispersion séquentielle du reporter dans d’autres parties de la plante démontrera la communication intercellulaire. Bien que le mécanisme d’absorption des colorants ne soit pas pleinement compris, le principe sous-jacent du mouvement des FC à l’intérieur des cellules vivantes a été largement reconnu. La forme ester de CF (diacétate des FC, CFDA) est non-fluorescente, mais perméable à la membrane. Cette propriété permet la diffusion rapide de la membrane du colorant dans les cellules. Une fois à l’intérieur des cellules vivantes, les estérases intracellulaires éliminent les groupes d’acétate à la position 3 ‘et 6 ‘de la CFDA, libérant les CF fluorescentes et imperméables à la membrane (figure 1, alternativement, Wright et al.2); Les FC peuvent alors se déplacer à travers les plasmodesmes vers d’autres parties de plantes.
Une procédure bien établie avec CFDA est qu’il peut être chargé dans les feuilles de source et utilisé pour surveiller le streaming phloème et le déchargement du phloème dans les tissus de l’évier de nombreuses espèces, par exemple, comme le déchargement des FC dans la racine Arabidopsis 5, le déchargement phloème pendant la tuberisation de la pomme de terre6, le déchargement du phloème dans l’évier Nicotiana laisse7, et ainsi de suite. Par des approches de chargement similaires, d’autres études ont adopté ce colorant pour démontrer la liaison symplasique entre l’hôte et le parasite8,9, ou pour révéler les relations symbiotiques10,11.
Une autre façon de faire usage de ce colorant est de le charger dans des cellules spécifiques ou une seule cellule par microinjection pour déterminer son modèle de distribution. De telles techniques sophistiquées ont grandement facilité notre compréhension plus approfondie de la communication intercellulaire médiée par plasmodesmata, en particulier dans le développement du concept de domaine symplastique12,13. Par exemple, la microinjection de CFDA dans les cellules de cotylédons de l’ Arabidopsis a entraîné le modèle de couplage de colorant dans l’épiderme de l’hypocotyle, mais sans couplage dans les cellules sous-jacentes ou dans l’épiderme des racines, par conséquent l’épiderme hypocotyle forme une domaine symplastique14. Des domaines similaires, tels que les cellules de la garde stomatale15, les cellules de l’élément-compagnon16, les cellules capillaires14 et la coiffe des racines17,18 ont été identifiés par la technique de la microinjection. Le plus surprenant, certains domaines permettent aux molécules traceurs de se déplacer dans une certaine direction. Prenez le domaine de trichome par exemple, la microinjection d’une sonde fluorescente dans la cellule épidermique de soutien conduit au flux de traceur dans le domaine de trichome, cependant, l’injection inverse ne tient pas vrai19. Un rapport récent a également trouvé des situations similaires dans les domaines symplasiques de l’embryon Sedum 20. Ainsi, tous les cas ci-dessus impliquent que l’échange de sites de chargement peut conduire à de nouveaux aperçus de la communication symplastique. Notre expérience précédente visant à disséquer la voie du silençage mobile de la racine à la pousse a identifié un nouveau domaine symplastique, ou la zone Hej (hypocotyle-épicotyle), qui a été vérifiée par le chargement des racines (chargement de l’évier non canonique) CFDA l’expérience21. Ici, nous élaborons en outre le mouvement de la racine à la pousse des FC en utilisant une méthode simple et de récupérer un domaine symplastique potentiel en déplaçant les sites de chargement. En outre, cette procédure peut être adaptée pour différencier les antécédents génétiques qui ont modifié le transport de longue distance de la racine à la pousse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des études émergentes ont montré que les plantes peuvent réagir rapidement aux stimuli externes23, y compris la manipulation introduite dans les procédures expérimentales22. Dans notre expérience initiale, notre surveillance de cette connaissance conduit souvent à l’échec de coloration. Avec ces leçons, nous suggérons que les précautions suivantes doivent être maintenues à l’esprit lors de l’exécution de cette expérience: (1) les semences après la ré…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de la Chine (31671257) et le centre d’innovation collaborative Hubei pour l’industrie céréalière (LXT-16-18).
Materials
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade | |
References
- Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
- Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
- Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
- Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
- Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
- Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
- Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
- Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
- Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
- Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
- Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
- Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
- Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
- Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
- van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
- Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
- Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
- Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
- Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
- Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
- Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
- Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
- Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?. Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).
