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Ricerca sul cancro

インビタルイメージングと固定組織解析を用いた癌細胞播種に伴う転移戸管媒介血管透過性の腫瘍微小環境の評価

Published: June 26, 2019
doi:
10.3791/59633
, , , , , , ,
1Department of Anatomy and Structural Biology,Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center,Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program,Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery,Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology,Montefiore Medical Center

Summary

マウスにおける高分子量(155kDa)デキストランの静脈注射を用いて、転移(TMEM)戸口機能および癌細胞イントラバシスの腫瘍微小環境に関連する一過性血管透過性を評価する2つの方法について述べた。この方法には、生きた動物におけるインビタルイメージングと免疫蛍光を用いた固定組織分析が含まれる。

Abstract

癌関連死亡率の最も一般的な原因は転移であり、原発性腫瘍から二次部位への癌細胞の普及を必要とするプロセスである。近年、原発性乳癌および肺の転移部位における癌細胞の播種は、転移の腫瘍微小環境(TMEM)と呼ばれる出入り口でのみ起こることを確立した。TMEM出入口数は、乳癌患者における転移性疾患の遠隔再発について予後である。TMEM出入口は、これらの細胞の両方が血液に密着しているTIE2およびVEGFの高レベルを発現する前血管異性マクロファージと直接接触してアクチン調節タンパク質メナを過剰発現する癌細胞で構成されています。血管内皮細胞。癌細胞は、TMEM関連マクロファージおよびTMEM関連メナ発現癌細胞の関節活性によって調整された一過性血管透過性のためにTMEM出入口を通ってイントラバサテることができる。本原稿では、TMEM媒介過渡血管透過性の評価のための2つの方法について、インビタルイメージングと固定組織免疫蛍光について述べた。どちらの方法にも長所と短所がありますが、この2つを組み合わせることで、TMEM媒介血管透過性の最も完全な分析と、TMEM機能の微小環境前提条件が提供される可能性があります。乳癌における転移過程、およびおそらく他のタイプの癌は、TMEM出入口を介した癌細胞の普及を伴うので、TMEM出入り口活動の分析のために十分に確立された方法を採用することが不可欠である。ここで説明する2つの方法は、がん細胞を予防する薬剤の前臨床試験において最も重要である、ナイーブまたは薬理学的に処置された動物におけるTMEM出入り口活動の分析に対する包括的なアプローチを提供する。TMEMを通じて普及しています。

Introduction

がん転移に関する我々の理解の最近の進歩は、上皮間葉転移(EMT)と移動性/侵襲性癌細胞の細胞下集団の誘導は、それ自体では、発散性の普及に十分ではないことを明らかにした。1.確かに、腫瘍新生物は、癌関連内皮の全体を通して転移する癌細胞は、しばしば低膜球カバレッジによって特徴付けられ、そのように、非常に透過性が高いと考えられていた。不安定な2,3,4.腫瘍内の欠陥機能を非常に示唆しているが、発癌中の血管修飾は、腫瘍細胞が容易かつ制御不能な方法で血管に浸透できるという証拠をそれ以上に提供しない。腫瘍細胞が蛍光タグ付きで、血管系が蛍光プローブ(デキストランや量子ドットなど)の静脈注射によって標識されるインビタルイメージング(IVI)研究からの洞察は、腫瘍血管が均一である一方で、そのことを示している。低分子量デクトランス(例えば70kD)、高分子量デキストランス(155kD)および腫瘍細胞に透過可能であり、血管分岐点5に優先的に位置するイントラバセーションの特殊部位でのみ内皮を横切ることができる。6,7.動物モデルとヒト患者由来材料を用いた免疫組織化学(IHC)分析は、これらの部位が血管透過性を調節することに特化した「出入り口」であることを示している。移動/浸潤性癌細胞が循環に入る機会。これらの出入り口は「転移の腫瘍微小環境」または「TMEM」と呼ばれ、その密度は乳癌患者8,9の転移性疾患を発症するリスクの増加と相関する。 10.

各TMEM出入口は、3つの異なるタイプの細胞で構成されています:血管間マクロファージ、アクチン調節タンパク質哺乳動物を過剰発現する腫瘍細胞(Mena)、および内皮細胞は、すべて互いに直接物理的に接触し、1、 5,9,10,11,12,13.TMEMをイントラバゼーションの出入り口として機能させる重要な事象は、血管内皮成長因子(VEGF)が血管皮下マクロファージ14によって基礎血管に局所的に放出される。VEGFは、内皮細胞間の同質接合部を破壊することができる15,16,17,18,19,一過性血管漏出をもたらす現象, また、IVI研究5で説明されているように「破裂」透過性として知られています。TMEMマクロファージは、VEGF媒介TMEM機能およびこれらのマクロファージの発現に必要なチロシンキナーゼ受容体TIE2を発現することが示されている5,20,21,22.癌細胞の播種および転移を調節することに加えて、TIE2+マクロファージは腫瘍血管新生の中心調節因子であることが示されている21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31.したがって、TIE2+マクロファージは、腫瘍微小環境および転移カスケードの主な調節管の重要な構成要素を表す。

TMEM媒介血管透過性(すなわち「破裂」)をより概念化するためには、内皮細胞接合部の溶解に関連しない他の血管透過性のモードと区別することが非常に重要である。無傷の内皮(接合部と接合部が破壊されないもの)では、(a)ピノサイトシスは、摂取された物質の経血症と結合してもよいし、そうでないかもしれない、という3つの主要なタイプがある。(b) 内皮フェネストレーを介した材料の輸送;(c)内皮タイトジャンクション15,16,17,18,19,32によって調節される前細胞経路を介した物質の輸送,33歳,34.多くの腫瘍で調節が緩やかであるが、前述の血管透過性の様式は、主に正常組織生理学および恒常性の文脈において説明されてきたが、その極端なは、透過性が制限された組織である(例えば、血液脳関門、血液精巣関門、または豊富な透過性(例えば、腎臓糸球体装置の毛細血管をフェネストした)34、35、36、37。

多光子インビタルイメージングと多重免疫蛍光顕微鏡を用いて、TMEM媒介血管透過性(「破裂」)と乳房腫瘍における血管透過性の他のモードを区別することができる。これを達成するために、我々は、マウスで高分子量、蛍光標識プローブの単一の静脈注射を行う。自発的な破裂イベントは、生きたマウスのインビタルイメージングを使用して捕捉することができます。あるいは、プローブの散用は、免疫蛍光顕微鏡を用いて血液血管系(例えばCD31+またはエンドムチン+)およびTMEM出入口との共局在研究によって定量化することができる。ここで説明するプロトコルは、これらの手法の両方について説明しています。

Protocol

生きた動物を用いるすべての実験は、動物の使用およびケアのガイドラインおよび規則に従って行われなければならない。本研究に記載されている手順は、実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所の規則に従い、アルバート・アインシュタイン医科動物ケア・アンド・ユースカレッジの承認を得て実施されました。委員会(IACUC)。 1. 生きた動物イメージングを用いて…

Representative Results

このプロトコルの記事で説明する実験手順を簡単に要約し、図 1A-Cに示します。 TMEM媒介血管透過性(「破裂活性」)を測定し、血管透過性の他のモードからの実験ノイズを低減するために(すなわち、細胞間および細胞間細胞を横断的に、導入で説明したように)、静脈内(すなわち)を行った。155 kDa Dextranのような高分子量プローブの注入は…

Discussion

ここでは、TMEM出入り口に存在し、血管タイトおよび接着接合部の破壊に関連する特定のタイプの血管透過性を可視化および定量化するために適用できる2つのプロトコルを概説する。このタイプの血管透過性は、上述の5として、三者TMEM細胞複合体によって一過性および制御される。TMEM関連血管透過性を同定し定量する能力は、転移性癌細胞微小環境の評価、ならびに腫瘍?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

アルバート・アインシュタイン医科大学の分析イメージング施設(AIF)に対し、イメージング支援を行ってくださったことに感謝します。この研究は、NCI(P30CA013330、CA150344、CA100324、CA216248)、SIG 1S10OD019961-01、グラスリッパーバイオフォトニクスセンターとその統合イメージングプログラム、モンテフィオレのルース・グラント・グラント・グラント・グラントの助成金によって支えられた。腫瘍微小環境の研究のため(CA200561)。

GSKは原稿を共同執筆し、図1Cおよび3Bのイメージングを行い、固定組織分析プロトコルを開発し、すべてのデータを分析および解釈した。JMPは原稿を共同執筆し、図1B、2C及び3Aの手術及びインビタルイメージングを行った。LB & ACは、図 2B の手術とバイタルイメージングを行いました。RJは図2Aの手術およびインビタルイメージングを行った。JSCは原稿を共同執筆し、すべてのデータを分析・解釈した。MHOは原稿を共同執筆し、すべてのデータを分析し、解釈しました。DEは図2Dの手術とインビタルイメージングを行い、原稿を共同執筆し、固定組織解析とインビタルイメージングプロトコルを開発し、すべてのデータを分析および解釈した。

Materials

Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835
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Karagiannis, G. S., Pastoriza, J. M., Borriello, L., Jafari, R., Coste, A., Condeelis, J. S., Oktay, M. H., Entenberg, D. Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis. J. Vis. Exp. (148), e59633, doi:10.3791/59633 (2019).
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