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Ricerca sul cancro

Évaluation du microenvironnement tumoral de la perméabilité vasculaire médiée par la voie de la metastasie associée à la dissémination des cellules cancéreuses à l'aide de l'imagerie intravitale et de l'analyse des tissus fixes

Published: June 26, 2019
doi:
10.3791/59633
, , , , , , ,
1Department of Anatomy and Structural Biology,Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center,Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program,Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery,Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology,Montefiore Medical Center

Summary

Nous décrivons deux méthodes pour évaluer la perméabilité vasculaire transitoire liée au microenvironnement de tumeur de la fonction de porte de métastasie (TMEM) et de l’intravasation de cellules cancéreuses utilisant l’injection intraveineuse du poids moléculaire élevé (155 kDa) dextran chez les souris. Les méthodes incluent l’imagerie intravitale chez les animaux vivants et l’analyse des tissus fixes à l’aide de l’immunofluorescence.

Abstract

La cause la plus fréquente de mortalité liée au cancer est la métastasie, un processus qui nécessite la dissémination des cellules cancéreuses de la tumeur primaire aux sites secondaires. Récemment, nous avons établi que la dissémination de cellules cancéreuses dans le cancer du sein primaire et aux emplacements métastatiques dans le poumon se produit seulement aux portes appelées microenvironnement de tumeur de la métastase (TMEM). Le nombre de porte de TMEM est pronostique pour la répétition éloignée de la maladie métastatique dans les patients de cancer du sein. Les portes tMEM sont composées d’une cellule cancéreuse qui sur-exprime la protéine régulatrice d’actine Mena en contact direct avec un macrophage périvasculaire et proangiogénique qui exprime des niveaux élevés de TIE2 et de VEGF, où ces deux cellules sont étroitement liées à un sang cellule endothéliale du navire. Les cellules cancéreuses peuvent intravasate par les portes TMEM en raison de la perméabilité vasculaire transitoire orchestrée par l’activité conjointe du macrophage TMEM-associé et de la cellule cancéreuse Mena-exprimant TMEM-associée. Dans ce manuscrit, nous décrivons deux méthodes pour l’évaluation de la perméabilité vasculaire transitoire TMEM-négociée : la formation image intravitale et l’immunofluorescence fixe de tissu. Bien que les deux méthodes aient leurs avantages et inconvénients, la combinaison des deux peut fournir les analyses les plus complètes de la perméabilité vasculaire TMEM-négociée ainsi que des prérequis microenvironnementaux pour la fonction TMEM. Étant donné que le processus métastatique dans le cancer du sein, et peut-être d’autres types de cancer, implique la dissémination des cellules cancéreuses par les portes TMEM, il est essentiel d’employer des méthodes bien établies pour l’analyse de l’activité de porte TMEM. Les deux méthodes décrites ici fournissent une approche globale de l’analyse de l’activité de porte TMEM, soit chez les animaux naïfs ou pharmacologiquement traités, ce qui est d’une importance primordiale pour les essais précliniques d’agents qui préviennent les cellules cancéreuses diffusion par TMEM.

Introduction

Les progrès récents dans notre compréhension de la métastes du cancer ont mis au jour que la transition épithéliale-mésenchymale (EMT) et l’induction d’une sous-population de cellules cancéreuses migratrices/invasives ne sont pas, en elles-mêmes, suffisantes pour la dissémination hématogène 1. En effet, on pensait auparavant que la métastisation des cellules cancéreuses intravasate à travers l’ensemble de l’endothélium associé au cancer que la tumeur neovasculature est souvent caractérisée par une faible couverture péritéyte, et en tant que tel, est très perméable et instable2,3,4. Bien que fortement suggestif des fonctions défectueuses dans la tumeur, les modifications vasculaires pendant la carcinogenèse ne fournissent pas l’évidence en soi que les cellules de tumeur peuvent pénétrer des vaisseaux sanguins facilement et d’une manière incontrôlée. Les connaissances issues d’études d’imagerie intravitale (IVI), dans lesquelles les cellules tumorales sont étiquetées de façon fluorescente et où la vascularisation est étiquetée par l’injection intraveineuse de sondes fluorescentes (comme le dextran ou les points quantiques), montrent que, bien que les vaisseaux tumoraux soient uniformément perméable à faible poids moléculaire dextrans (par exemple 70 kD), dextrans de poids moléculaire élevé (155 kD) et les cellules tumorales ne peuvent traverser l’endothélium que dans des sites spécialisés d’intravasation qui sont préférentiellement situés au point de branche vasculaire5, 6 Annonces , 7. Les analyses immunohistochimiques (IHC) à l’aide de modèles animaux et de matériel dérivé du patient humain ont montré que ces sites sont des « portes » qui se spécialisent dans la régulation de la perméabilité vasculaire, localement et transitoirement, offrant une brève fenêtre de l’occasion pour les cellules cancéreuses migratrices/invasives d’entrer dans la circulation. Ces portes sont appelées « microenvironnement de tumeur de métastase » ou « TMEM », et, tout à fait prévu, leur densité corrèle avec un plus grand risque de développer la maladie métastatique dans les patients de cancer du sein8,9, 10.

Chaque porte TMEM se compose de trois types distincts de cellules: un macrophage périvasculaire, une cellule tumorale surexprimant l’actin-régulateur mammifère protéine activée (Mena), et une cellule endothéliale, le tout en contact physique direct les uns avec les autres1, 5,9,10,11,12,13. L’événement clé pour la fonction de TMEM comme porte d’intravasation est la libération localisée du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) sur le vaisseau sous-jacent par le macrophage périvasculaire14. VEGF peut perturber les jonctions homotypic entre les cellules endothéliales15,16,17,18,19, un phénomène qui se traduit par des fuites vasculaires transitoires, aussi la perméabilité « éclatante » décrite dans les études iVI 5. TMEM macrophages ont été montrés pour exprimer le récepteur de kinase de tyrosine TIE2, qui est exigé pour la fonction de TMEM VEGF-négociée et homing de ces macrophages à la niche périvasculaire5,20,21 , 22. En plus de réguler la dissémination des cellules cancéreuses et la métastase, TIE2– macrophages se sont avérés être les régulateurs centraux de l’angiogenèse tumorale21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. En tant que tel, les macrophages TIE2 représentent un constituant critique du microenvironnement tumoral et le régulateur principal de la cascade métastatique.

Pour mieux conceptualiser la perméabilité vasculaire médiée par TMEM (c.-à-d. « éclatement »), il est très important de la distinguer des autres modes de perméabilité vasculaire qui ne sont pas associés à la dissolution des jonctions cellules-cellules endothéliales. Dans un endothélium intact (dont les jonctions serrées et adhérentes ne sont pas perturbées), il existe trois principaux types de perméabilité vasculaire : a) la pinocytose, qui peut, ou non, être couplée à la transcytose du matériau ingéré; b) le transport du matériel par fenestrae endothélial; et c) le transport du matériel par la voie paracellulaire, qui est réglée par les jonctions serrées endothéliales15,16,17,18,19,32 , 33 Ans, états-unis ( , 34. Bien que déréglementés dans beaucoup de tumeurs, les modes mentionnés ci-dessus de perméabilité vasculaire ont été décrits principalement dans le contexte de la physiologie normale de tissu et de l’homéostasie, les extrêmes dont sont des tissus avec la perméabilité limitée ( par exemple, barrière hémato-encéphalique, barrière de test sanguin), ou perméabilité abondante (p. ex., capillaires fenestrés de l’appareil glomerulaire rénal)34,35,36,37.

À l’aide de la formation image intravitale multiphoton et de la microscopie multixée d’immunofluorescence, nous sommes en mesure de distinguer entre la perméabilité vasculaire Médiée TMEM (« éclatement ») et d’autres modes de perméabilité vasculaire dans les tumeurs mammaires. Pour ce faire, nous effectuons une seule injection intraveineuse d’une sonde de poids moléculaire de haut poids, étiquetée fluorescente chez la souris. Les événements spontanés d’éclatement peuvent alors être capturés utilisant l’imagerie intravitale chez les souris vivantes ; ou alternativement, l’extravasation de la sonde peut être quantifiée par des études de co-localisation avec la vascularisation de sang (par exemple CD31ou Endomucin)et les portes de TMEM utilisant la microscopie d’immunofluorescence. Les protocoles présentés ici décrivent ces deux techniques, qui pourraient être utilisées indépendamment ou en conjonction les unes avec les autres.

Protocol

Toutes les expériences à l’aide d’animaux vivants doivent être menées conformément aux lignes directrices et règlements sur l’utilisation et les soins des animaux. Les procédures décrites dans cette étude ont été réalisées conformément aux règlements des National Institutes of Health concernant les soins et l’utilisation des animaux expérimentaux et avec l’approbation de l’Albert Einstein College of Medicine Animal Care and Use (IACUC). 1. Évaluation de la « perméabilité écl…

Representative Results

Les procédures expérimentales décrites dans cet article de protocole sont brièvement résumées et illustrées dans la figure 1A-C. Pour mesurer la perméabilité vasculaire médiée par TMEM (« activité d’éclatement ») et pour réduire le bruit expérimental d’autres modes de perméabilité vasculaire (c.-à-d. transcellulaire et paracellulaire, comme expliqué dans l’introduction), nous avons effectué l’intraveineuse (i.v.) injection de…

Discussion

Ici, nous énoncions deux protocoles qui peuvent être appliqués pour visualiser et quantifier un type spécifique de perméabilité vasculaire qui est présent aux portes de TMEM et est associé à la perturbation des jonctions vasculaires serrées et adhérentes. Ce type de perméabilité vasculaire est transitoire et contrôlé par le complexe cellulaire tripartite TMEM, tel qu’expliqué ci-dessus5. La capacité d’identifier et de quantifier la perméabilité vasculaire TMEM-associée est cruc…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier l’Installation d’imagerie analytique (AIF) de l’Albert Einstein College of Medicine pour son soutien en imagerie. Ce travail a été soutenu par des subventions du NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 et CA216248), du SIG 1S10OD019961-01, du Gruss-Lipper Biophotonics Center et de son Programme d’imagerie intégrée, et de Ruth L. Kirschstein T32 de Montefiore pour l’étude du microenvironnement tumoral (CA200561).

GSK a co-écrit le manuscrit, réalisé l’imagerie pour la figure 1C et 3B, développé un protocole d’analyse des tissus fixes et analysé et interprété toutes les données; JMP a co-écrit le manuscrit et a effectué la chirurgie et l’imagerie intravitale pour la figure 1B,2C et 3A; LB et AC ont effectué la chirurgie et l’imagerie intravitale pour la figure 2B; RJ a effectué la chirurgie et l’imagerie intravitale pour la figure 2A; JSC a co-écrit le manuscrit et analysé et interprété toutes les données; MHO a co-écrit le manuscrit et analysé et interprété toutes les données; et DE a effectué la chirurgie et l’imagerie intravitale pour la figure 2D, a co-écrit le manuscrit, a développé l’analyse fixe des tissus et des protocoles d’imagerie intravitale, et a analysé et interprété toutes les données.

Materials

Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835
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Karagiannis, G. S., Pastoriza, J. M., Borriello, L., Jafari, R., Coste, A., Condeelis, J. S., Oktay, M. H., Entenberg, D. Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis. J. Vis. Exp. (148), e59633, doi:10.3791/59633 (2019).
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