JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ricerca sul cancro

Оценка опухолевой микросреды метастазов Doorway-Mediated Сосудистая проницаемость, связанная с распространением раковых клеток с помощью интравитального изображения и фиксированного анализа тканей

Published: June 26, 2019
doi:
10.3791/59633
, , , , , , ,
1Department of Anatomy and Structural Biology,Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center,Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program,Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery,Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology,Montefiore Medical Center

Summary

Мы описываем два метода оценки преходящей сосудистой проницаемости, связанной с микроокружением опухоли метастазов (TMEM) функции дверного проема и интравацией раковых клеток с использованием внутривенной инъекции высокомолекулярного веса (155 кДа) декентна у мышей. Методы включают интравитальная визуализация у живых животных и анализ фиксированной ткани с использованием иммунофлюоресценции.

Abstract

Наиболее распространенной причиной смертности, связанной с раком, является метастаз, процесс, который требует распространения раковых клеток от первичной опухоли до вторичных участков. Недавно мы установили, что распространение раковых клеток в первичном раке молочной железы и в метастатических участках в легких происходит только в дверях называется Опухолевая микроокружающая среда метастазов (TMEM). Номер дверного проема TMEM является прогностичным для отдаленного рецидива метастатических заболеваний у больных раком молочной железы. TMEM дверные проемы состоят из раковой клетки, которая чрезмерно выражает актин регуляторного белка Mena в прямом контакте с периваскулярным, проангиогенным макрофагом, который выражает высокий уровень TIE2 и VEGF, где обе эти клетки плотно связаны с кровью сосуд эндотелиальной клетки. Раковые клетки могут интравироваться через дверные проемы TMEM из-за преходящей сосудистой проницаемости, организованной совместной деятельностью ассоциированного макрофага TMEM и тМЭм-ассоциированной раковой клетки Mena. В этой рукописи мы описываем два метода оценки преходящей проницаемости ТМЭм: интравитальная визуализация и иммунофлуоресценция фиксированной ткани. Хотя оба метода имеют свои преимущества и недостатки, объединение этих двух методов может обеспечить наиболее полный анализ проницаемости сосудов, опосредованных ТМЭМ, а также микроэкологических предпосылок для функции ТМЭм. Поскольку метастатический процесс при раке молочной железы, и, возможно, другие виды рака, включает в себя распространение раковых клеток через tMEM дверные проемы, важно использовать хорошо зарекомендовавшие себя методы для анализа TMEM дверной проем деятельности. Два описанных здесь метода обеспечивают комплексный подход к анализу активности дверных проемов TMEM, как у наивных, так и в фармакологически обработанных животных, что имеет первостепенное значение для доклинических испытаний агентов, предотвращающих раковые клетки распространения через TMEM.

Introduction

Недавние достижения в нашем понимании метастазов рака обнаружили, что эпителиальный переход к мезенхимальному переходу (ЭМТ) и индукции мигрирующих/инвазивных субпопуляций раковых клеток сами по себе не являются достаточными для распространения гематогенов 1. Действительно, ранее считалось, что метастазирующие раковые клетки интравируются через всю всю вызванное раком эндотелия, так как неваскулярность опухоли часто характеризуется низким охватом перицитов, и как таковой, очень проницаема и нестабильный2,3,4. Хотя очень наводящий дефектных функций в опухоли, сосудистые изменения во время канцерогенеза не дают доказательств как таковых, что опухолевые клетки могут проникать кровеносные сосуды легко и неконтролируемым образом. Исследования интражизненной визуализации (IVI), в которых опухолевые клетки флуоресцентно помечены и сосуды помечены через внутривенную инъекцию флуоресцентных зондов (таких как декренилий или квантовые точки), показывают, что, в то время как опухолевые сосуды равномерно проницаемый до низкого молекулярного веса декстранс (например, 70 кД), высокомолекулярный вес декстранс (155 кД) и опухолевые клетки могут пересекать эндотелий только на специализированных участках интравазации, которые преимущественно расположены в сосудистой точке5, 6 , 7. Иммуногистохимический (IHC) анализы с использованием моделей животных и человеческого человека, полученных материал омичи показали, что эти сайты являются “дверные проемы”, которые специализируются на регулировании проницаемости сосудов, локально и преходяще, обеспечивая краткое окно возможность для мигрирующих/инвазивных раковых клеток для входа в кровообращение. Эти дверные проемы называются “Tumor Microenvironment of Metastasis” или “TMEM”, и, вполне ожидаемо, их плотность коррелирует с повышенным риском развития метастатического заболевания у больных раком молочной железы8,9, 10.

Каждый дверной проем TMEM состоит из трех различных типов клеток: периваскулярный макрофаг, опухолевые клетки, чрезмерно выражающие актин-регуляторный белок млекопитающих включен (Mena), и эндотелиальной клетки, все в прямом физическом контакте друг с другом1, 5,9,10,11,12,13. Ключевым событием для функции TMEM как внутривазивного дверного проема является локализованное высвобождение сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) на основной сосуд периваскулярным макрофагом14. VEGF может нарушить гомотипические соединения между эндотелиальными клетками15,16,17,18,19, явление, которое приводит к переходной утечки сосудов, также известный как “взрыв” проницаемость, как описано в исследованиях IVI 5. TMEM макрофаги были показаны, чтобы выразить рецептор тирозинкиназы TIE2, который необходим для VEGF-опосредованной функции TMEM и самонаведения этих макрофагов в периваскулярной нише5,20,21 , 22. В дополнение к регулированию распространения раковых клеток и метастазов, TIE2и макрофаги, как было показано, центральные регуляторы опухолевого ангиогенеза21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Таким образом, макрофаги TIE2и представляют собой критический компонент микроокружения опухоли и основной регулятор метастатического каскада.

Для лучшей концептуализации TMEM-опосредованной сосудистой проницаемости (т.е. “взрыв”), очень важно отличить его от других способов проницаемости сосудов, которые не связаны с роспуском эндотелиальных клеточных соединений. В нетронутом эндотелии (тот, чьи тесные и адепты не нарушены), есть три основных типа проницаемости сосудов: а) пиноцитоз, который может или не может быть связан с трансцитозом проглоченного материала; b) транспортировка материала через эндотелиальную фенестру; и с) транспортировка материала по параклеточному пути, который регулируется эндотелиальными узкими соединениями15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. Хотя дерегулированы во многих опухолей, вышеупомянутые способы проницаемости сосудов были описаны в основном в контексте нормальной физиологии тканей и гомеостаза, крайности которых являются ткани с ограниченной проницаемостью ( например, гематоэнцефалический барьер, гематоэнцефалический барьер), или обильная проницаемость (например, фенестрированные капилляры почечного гломерулярного аппарата)34,35,36,37.

Используя мультифотонную интравитальная визуализацию и мультиплексированную иммунофлуоресценционную микроскопию, мы можем различать проницаемость сосудов tMEM (“взрыв”) и другие способы проницаемости сосудов при опухолях молочной железы. Для этого мы выполняем одну внутривенную инъекцию высокомолекулярного веса, флуоресцентно маркированного зонда у мышей. Спонтанное взрывное время событий может быть захвачено с помощью интравитентной визуализации у живых мышей; или, в качестве альтернативы, экстравазивание зонда может быть количественно путем совместного исследования локализации с сосудами крови (например, CD31 или Эндомуцин)и TMEM дверные проемы с использованием иммунофлюоресценции микроскопии. Представленные здесь протоколы описывают оба этих метода, которые могут использоваться либо самостоятельно, либо в сочетании друг с другом.

Protocol

Все эксперименты с использованием живых животных должны проводиться в соответствии с руководящими принципами и правилами в отношении использования животных и ухода за животными. Процедуры, описанные в данном исследовании, были проведены в соответствии с национальными правилами здра…

Representative Results

Экспериментальные процедуры, описанные в настоящей статье протокола, кратко обобщены и проиллюстрированы на рисунке 1A-C. Для измерения проницаемости сосудов TMEM (“всплесковой активности”) и снижения экспериментального шума от других способов про…

Discussion

Здесь мы намечаем два протокола, которые могут быть применены для визуализации и количественной оценки определенного типа сосудистой проницаемости, которая присутствует в дверных проемах TMEM и связана с нарушением сосудистой плотности и связей. Этот тип проницаемости сосудов являетс?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Аналитический центр визуализации (AIF) в Медицинском колледже Альберта Эйнштейна за поддержку изображений. Эта работа была поддержана грантами NCI (P30CA0133330, CA150344, CA 100324 и CA216248), SIG 1S10OD019961-01, Центр биофотоники Gruss-Lipper и его комплексная программа визуализации, а также Рут Грантштейн из Montefiore для исследования микроокружения опухоли (CA200561).

ГСК совместно писала рукопись, выполняла визуализацию для фигур 1С и 3В, разработала протокол анализа фиксированной ткани, проанализировала и интерпретировала все данные; JMP совместно написал рукопись, и выполнил операцию и интравитальной визуализации для рисунка 1B,2C и 3A; LB и AC выполнили операцию и интравитальной визуализации для Рисунок 2B; RJ выполнил операцию и интравитальной визуализации для Рисунок 2A; ОАО является соавтором рукописи, проанализировало и интерпретировало все данные; MHO совместно написал рукопись и проанализировал и интерпретировал все данные; и DE выполнили операцию и интравитальной визуализации для рисунка 2D, соавтором рукописи, разработал и разработал анализ фиксированной ткани и внутрижизненной протоколы визуализации, а также проанализировали и интерпретировали все данные.

Materials

Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Ricerca sul cancro. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42 (2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112 (2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Ricerca sul cancro. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Ricerca sul cancro. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75 (2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Ricerca sul cancro. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271 (2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

Tags

Tumor MicroenvironmentTMEMVascular PermeabilityCancer Cell DisseminationIntravital ImagingDextranTumor TransplantationMacrophagesMammary Fat PadExtracellular MatrixTail Vein Catheter
check_url/it/59633?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Karagiannis, G. S., Pastoriza, J. M., Borriello, L., Jafari, R., Coste, A., Condeelis, J. S., Oktay, M. H., Entenberg, D. Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis. J. Vis. Exp. (148), e59633, doi:10.3791/59633 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image