Beurteilung der Tumormikroumgebung von Metastasierung Doorway-Vermittelte Vaskuläre Durchlässigkeit im Zusammenhang mit der Krebszellverbreitung mit Intravital Imaging und Fixed Tissue Analysis
Summary
Wir beschreiben zwei Methoden zur Beurteilung der transienten vaskulären Permeabilität im Zusammenhang mit der Tumormikroumgebung der Metastasenfunktion (TMEM) und der Krebszellintravasation unter intravenöser Injektion von hochmolekularem Dextran (155 kDa) bei Mäusen. Die Methoden umfassen intravitale Bildgebung bei lebenden Tieren und feste Gewebeanalyse mittels Immunfluoreszenz.
Abstract
Die häufigste Ursache für krebsbedingte Mortalität ist Metastasierung, ein Prozess, der die Verbreitung von Krebszellen vom Primärtumor an sekundäre Stellen erfordert. Kürzlich haben wir festgestellt, dass die Verbreitung von Krebszellen bei primärem Brustkrebs und an metastasierenden Stellen in der Lunge nur an Türöffnungen auftritt, die als Tumor MicroEnvironment of Metastasis (TMEM) bezeichnet werden. TMEM Türnummer ist prognostisch für das ferne Wiederauftreten von metastasierenden Erkrankungen bei Brustkrebspatientinnen. TMEM-Türen bestehen aus einer Krebszelle, die das Aktin-Regulierungsprotein Mena in direktem Kontakt mit einem perivaskulären, proangiogenen Makrophagen überausdrückt, das einen hohen ANTEIL an TIE2 und VEGF ausdrückt, wo beide Zellen eng an ein Blut gebunden sind. Gefäß-Endothelzelle. Krebszellen können durch TMEM-Türen durch vorübergehende Gefäßdurchlässigkeit intravasiert werden, die durch die gemeinsame Aktivität des TMEM-assoziierten Makrophagens und der TMEM-assoziierten Mena-exekuitienten Krebszelle orchestriert wird. In diesem Manuskript beschreiben wir zwei Methoden zur Beurteilung der TMEM-vermittelten transienten vaskulären Permeabilität: intravitale Bildgebung und fixe Gewebeimmunfluoreszenz. Obwohl beide Methoden ihre Vor- und Nachteile haben, kann die Kombination der beiden Methoden die umfassendsten Analysen der TMEM-vermittelten Gefäßdurchlässigkeit sowie mikroökologische Voraussetzungen für die TMEM-Funktion liefern. Da der metastasierende Prozess bei Brustkrebs und möglicherweise anderen Krebsarten die Verbreitung von Krebszellen über TMEM-Türen beinhaltet, ist es wichtig, gut etablierte Methoden für die Analyse der TMEM-Türbahnaktivität einzusetzen. Die beiden hier beschriebenen Methoden bieten einen umfassenden Ansatz für die Analyse der TMEM-Türbahnaktivität, entweder bei naiven oder pharmakologisch behandelten Tieren, was für präklinische Versuche mit Wirkstoffen, die Krebszellen verhindern, von größter Bedeutung ist. Verbreitung über TMEM.
Introduction
Jüngste Fortschritte in unserem Verständnis von Krebsmetastasen haben aufgedeckt, dass epitheliale in mesenchymale Übergänge (EMT) und die Induktion einer migranten-invasiven Krebszellsubpopulation für sich genommen nicht ausreichen, um hämatogene Verbreitung zu ermöglichen. 1. Tatsächlich wurde früher angenommen, dass metastasierende Krebszellen durch die Gesamtheit des krebsassoziierten Endothel intravasieren, da die Tumorneovaskulatur oft durch eine geringe Pericytabdeckung gekennzeichnet ist und als solche instabil2,3,4. Obwohl sehr suggestiv für defekte Funktionen innerhalb des Tumors, vaskuläre Modifikationen während der Karzinogenese liefern keinen Beweis per se, dass Tumorzellen Blutgefäße leicht und unkontrolliert durchdringen können. Erkenntnisse aus intravitalen Bildgebungsstudien (IVI), in denen Tumorzellen fluoreszierend markiert werden und die Vaskulatur über die intravenöse Injektion von Fluoreszenzsonden (wie Dextran oder Quantenpunkten) gekennzeichnet ist, zeigen, dass Tumorgefäße gleichmäßig sind, während durchlässige bis niedermolekulare Dextrans (z.B. 70 kD), hochmolekulare Dextrans (155 kD) und Tumorzellen können das Endothel nur an spezialisierten Stellen der Intravasation überqueren, die sich bevorzugt am GefäßzweigPunkt5 befinden, 6 , 7. Immunhistochemische (IHC) Analysen mit Tiermodellen und menschlichem Patientenmaterial haben gezeigt, dass diese Standorte “Türen” sind, die sich auf die lokale und vorübergehende Regulierung der Gefäßdurchlässigkeit spezialisieren und ein kurzes Fenster Möglichkeit für wandernde/invasive Krebszellen, in den Kreislauf einzudringen. Diese Türen werden “Tumor Microenvironment of Metastasis” oder “TMEM” genannt, und, sehr wahrscheinlich, ihre Dichte korreliert mit einem erhöhten Risiko, eine metastasierende Erkrankung bei Brustkrebspatientinnen zu entwickeln8,9, 10.
Jede TMEM-Tür besteht aus drei verschiedenen Zelltypen: einem perivaskulären Makrophagen, einer Tumorzelle, die das aktivierte actin-regulatorische ProteinSäugetier (Mena) überausexzätiert, und einer Endothelzelle, die alle in direktem körperlichen Kontakt miteinander stehen1, 5,9,10,11,12,13. Das Schlüsselereignis für die Funktion von TMEM als Intravasationstürweg ist die lokalisierte Freisetzung des vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktors (VEGF) auf das zugrunde liegende Gefäß durch das perivaskuläre Makrophagen14. VEGF kann homotypische Verbindungen zwischen Endothelzellen15,16,17,18,19, ein Phänomen, das zu vorübergehenden vaskulären Leckagen führt, als “Bursting”-Durchlässigkeit bekannt, wie in IVI-Studien 5beschrieben. ES hat sich gezeigt, dass TMEM-Makrophagen den Tyrosinkinase-Rezeptor TIE2 ausdrücken, der für die VEGF-vermittelte TMEM-Funktion und das Homing dieser Makrophagen in die perivaskuläre Nische5,20,21 , 22. Neben der Regulierung der Verbreitung und Metastasierung von Krebszellen haben sich TIE2+ Makrophagen als zentrale Regulatoren der Tumorangiogenese21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Als solche stellen TIE2+ Makrophagen einen kritischen Bestandteil der Tumormikroumgebung und den Hauptregulator der metastasierenden Kaskade dar.
Um die TMEM-vermittelte Gefäßdurchlässigkeit (d. h. “Bursting”) besser zu konzeptionieren, ist es sehr wichtig, sie von anderen Formen der Vaskulärendurchlässigkeit zu unterscheiden, die nicht mit der Auflösung von endothelialen Zell-Zell-Verbindungen verbunden sind. In einem intakten Endothel (eines, dessen enge und haftende Kreuzungen nicht gestört sind), gibt es drei Haupttypen der vaskulären Durchlässigkeit: a) Pinozytose, die an die Transzytose des aufgenommenen Materials gekoppelt werden kann oder auch nicht; b) Transport von Material durch endotheliale Fenestrae; und c) Transport von Material durch den parazellulären Weg, der durch endotheliale enge Kreuzungen geregelt wird15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. Obwohl bei vielen Tumoren dereguliert, wurden die oben genannten Formen der vaskulären Durchlässigkeit meist im Kontext der normalen Gewebephysiologie und Homöostase beschrieben, deren Extreme Gewebe mit entweder begrenzter Durchlässigkeit sind ( z.B. Blut-Hirn-Schranke, Blut-Testis-Schranke) oder reichlich Durchlässigkeit (z.B. fenestrated Kapillaren der Nierenglomerularapparat)34,35,36,37.
Mit Multiphoton intravital Imaging und Multiplexed Immunfluoreszenzmikroskopie sind wir in der Lage, zwischen TMEM-vermittelter vaskulärer Permeabilität (“Bursting”) und anderen Formen der vaskulären Permeabilität bei Brusttumoren zu unterscheiden. Um dies zu erreichen, führen wir eine einzige intravenöse Injektion einer hochmolekularen, fluoreszierend markierten Sonde bei Mäusen durch. Spontane Platzereignisse können dann mit intravitaler Bildgebung bei lebenden Mäusen erfasst werden; oder alternativ kann die Extravasation der Sonde durch Co-Lokalisierungsstudien mit Blutvaskulatur (z.B. CD31+ oder Endomucin+) und TMEM-Türen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden. Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben beide Techniken, die entweder unabhängig oder in Verbindung miteinander verwendet werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier skizzieren wir zwei Protokolle, die angewendet werden können, um eine bestimmte Art von Gefäßdurchlässigkeit zu visualisieren und zu quantifizieren, die an TMEM-Türen vorhanden ist und mit der Störung von Gefäßdicht- und Haftknoten verbunden ist. Diese Art der vaskulären Permeabilität wird durch den dreigliedrigen TMEM-Zellkomplex transient und kontrolliert, wie oben erläutert5. Die Fähigkeit, die MIT TMEM assoziierte Gefäßdurchlässigkeit zu identifizieren und zu quantifizieren…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Analytical Imaging Facility (AIF) des Albert Einstein College of Medicine für die unterstützung der Bildgebung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 und CA216248), der SIG 1S10OD019961-01, des Gruss-Lipper Biophotonics Center und seines Integrated Imaging Program und der Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant of Surgeons von Montefiore unterstützt. für die Studie der Tumormikroumgebung (CA200561).
GSK schrieb das Manuskript mit, führte Bildgebung für Abbildung 1C und 3B durch, entwickelte ein Protokoll zur Analyse fester Gewebe und analysierte und interpretierte alle Daten; JMP schrieb das Manuskript mit und führte die Operation und intravitale Bildgebung für Abbildung 1B,2C und 3A durch; LB & AC führte die Operation und intravitale Bildgebung für Abbildung 2B durch; RJ führte die Operation und intravitale Bildgebung für Abbildung 2A durch; JSC schrieb das Manuskript mit und analysierte und interpretierte alle Daten; MHO schrieb das Manuskript mit und analysierte und interpretierte alle Daten; und DE führte die Operation und intravitale Bildgebung für Abbildung 2D durch, schrieb das Manuskript mit, entwickelte feste Gewebeanalyse und intravitale Bildgebungsprotokolle und analysierte und interpretierte alle Daten.
Materials
| Anti-rabbit IgG (Alexa 488) | Life Technologies Corporation | A-11034 | |
| Anti-rat IgG (Alexa 647) | Life Technologies Corporation | A-21247 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Citrate | Eng Scientific Inc | 9770 | |
| Cover Glass Slips | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Cyanoacrylate Adhesive | Henkel Adhesive | 1647358 | |
| DAPI | Perkin Elmer | FP1490 | |
| Dextran-Tetramethyl-Rhodamine | Sigma Aldrich | T1287 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Endomucin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | |
| Enrofloxacin | Bayer | 84753076 v-06/2015 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Fish Skin Gelatin | Fisher Scientific | G7765 | |
| Insulin Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| Isofluorane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Matrigel | Corning | CB40234 | Artificial extracellular matrix |
| Needle (30 G) | Becton Dickinson | 305128 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | PBS | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | |
| Pulse Oximeter | Kent Scientific | MouseOx | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Quantum Dots | Life Technologies Corporation | Q21561MP | |
| Rubber | McMaster Carr | 1310N14 | |
| TMR (primary antibody) | Invitrogen | A6397 | |
| Tween-20 | MP Biologicals | TWEEN201 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 184835 |
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