मेटास्टेसिस डोरवे के ट्यूमर माइक्रोएनेवायरनमेंट का आकलन-मध्यस्थ संवहनी स्थायित्व कैंसर सेल प्रसार के साथ जुड़े इंट्राविटल इमेजिंग और फिक्स्ड ऊतक विश्लेषण का उपयोग कर
Summary
हम मेटास्टेसिस के ट्यूमर microenvironment के साथ जुड़े क्षणिक संवहनी permeability का आकलन करने के लिए दो तरीकों का वर्णन (TMEM) द्वार समारोह और कैंसर सेल intravasation उच्च आणविक वजन के अंतःशिरा इंजेक्शन का उपयोग कर (155 kDa) चूहों में डेक्सट्रान. तरीकों में जीवित जानवरों में इंट्राविटल इमेजिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके निश्चित ऊतक विश्लेषण शामिल हैं।
Abstract
कैंसर से संबंधित मृत्यु का सबसे आम कारण मेटास्टेसिस है, एक प्रक्रिया है कि प्राथमिक ट्यूमर से माध्यमिक साइटों के लिए कैंसर की कोशिकाओं के प्रसार की आवश्यकता है. हाल ही में, हम स्थापित किया है कि प्राथमिक स्तन कैंसर में कैंसर सेल प्रसार और फेफड़ों में metastatic साइटों पर केवल दरवाजे पर होता है Metastasis के ट्यूमर MicroEnvironment बुलाया (TMEM). TMEM द्वार संख्या स्तन कैंसर के रोगियों में मेटास्टैटिक रोग की दूर पुनरावृत्ति के लिए पूर्वानुमान है. TMEM द्वार एक कैंसर सेल से बना है जो actin नियामक प्रोटीन Mena एक perivascular, proangiogenic मैक्रोफेज जो TIE2 और VEGF, जहां इन दोनों कोशिकाओं के दोनों कसकर एक रक्त से बंधे हैं के उच्च स्तर को व्यक्त के साथ सीधे संपर्क में व्यक्त करता है वाहिका अंत:कक्षीय कोशिका. कैंसर कोशिकाओं TMEM दरवाजे के माध्यम से intravasate कर सकते हैं क्षणिक संवहनी पारगम्यता के कारण TMEM-संबद्ध मैक्रोफेज और TMEM संबद्ध Mena-expressing कैंसर सेल की संयुक्त गतिविधि द्वारा आर्केस्ट्रा. इस पांडुलिपि में, हम TMEM के आकलन के लिए दो तरीकों का वर्णन-मध्यस्थ क्षणिक पारगम्यता: intravital इमेजिंग और निश्चित ऊतक इम्यूनोफ्लोरेसेंस. हालांकि दोनों तरीकों को अपने फायदे और नुकसान है, दोनों के संयोजन TMEM-मध्यस्थ संवहनी पारगम्यता का सबसे पूरा विश्लेषण प्रदान कर सकते हैं और साथ ही TMEM समारोह के लिए सूक्ष्म पर्यावरण ीय वस्तुएँ. स्तन कैंसर में metastatic प्रक्रिया के बाद से, और संभवतः कैंसर के अन्य प्रकार, TMEM द्वार के माध्यम से कैंसर सेल प्रसार शामिल है, यह TMEM द्वार गतिविधि के विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से स्थापित तरीकों को रोजगार के लिए आवश्यक है. यहाँ वर्णित दो तरीकों TMEM द्वार गतिविधि के विश्लेषण के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं, या तो भोले या औषधीय इलाज जानवरों में, जो एजेंटों है कि कैंसर सेल को रोकने के पूर्व नैदानिक परीक्षणों के लिए सर्वोपरि महत्व का है TMEM के माध्यम से प्रसार.
Introduction
कैंसर मेटास्टेसिस की हमारी समझ में हाल ही में प्रगति का पर्दाफाश किया है कि उपकला-से-मेसेन्काइमल संक्रमण (ईएमटी) और एक प्रवासी / इनवेसिव कैंसर सेल उप-जनसंख्या को शामिल करने, अपने आप में, हेमेटोजेनसज प्रसार के लिए पर्याप्त नहीं हैं 1.वास्तव में, यह पहले सोचा था कि कैंसर की कोशिकाओं को कैंसर से जुड़े endothelium की संपूर्णता के माध्यम से metastasizing के रूप में ट्यूमर neovasculature अक्सर कम pericyte कवरेज की विशेषता है, और इस तरह के रूप में, अत्यधिक पारगम्य है और अस्थिर2,3,4. हालांकि ट्यूमर के भीतर दोषपूर्ण कार्यों के अत्यधिक विचारोत्तेजक, carcinogenesis के दौरान संवहनी संशोधनों से प्रति सबूत प्रदान नहीं करते हैं कि ट्यूमर कोशिकाओं को आसानी से और एक अनियंत्रित फैशन में रक्त वाहिकाओं घुसना कर सकते हैं. इंट्राविटल इमेजिंग (आईवीआई) अध्ययन से अंतर्दृष्टि, जिसमें ट्यूमर कोशिकाओं फ्लोरोसेंट-टैग किए गए हैं और वास्कुल्चर को फ्लोरोसेंट जांच (जैसे डेक्सट्रान या क्वांटम डॉट्स) के अंतःशिरा इंजेक्शन के माध्यम से लेबल किया जाता है, यह दिखाते हैं कि, जबकि ट्यूमर वाहिकाओं समान रूप से होते हैं कम आणविक वजन dextrans करने के लिए पारगम्य (उदा. 70 केडी), उच्च आणविक वजन डेक्सट्रांस (155 केडी) और ट्यूमर कोशिकाओं केवल intravasation के विशेष स्थलों पर endothelium पार कर सकते हैं जो अधिमानी संवहनी शाखा बिंदु5 पर स्थित हैं 6 , 7. इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) पशु मॉडल और मानव रोगी व्युत्पन्न सामग्री का उपयोग कर विश्लेषण से पता चला है कि इन साइटों “द्वार” है कि संवहनी पारगम्यता को विनियमित करने में विशेषज्ञ हैं, स्थानीय और क्षणिक, की एक संक्षिप्त खिड़की प्रदान प्रर्कुलित कैंसर कोशिकाओं के संचलन में प्रवेश करने का अवसर। इन दरवाजे कहा जाता है “मेटास्टेसिस के ट्यूमर Microenvironment” या “TMEM”, और, काफी उम्मीद है, उनके घनत्व स्तन कैंसर के रोगियों में मेटास्टैटिक रोग के विकास का एक बढ़ा जोखिम के साथ संबंधित8,9, 10|
प्रत्येक TMEM द्वार कोशिकाओं के तीन अलग अलग प्रकार के होते हैं: एक perivascular मैक्रोफेज, एक ट्यूमर सेल अधिक actin-नियामक प्रोटीन स्तनधारी सक्षम (Mena), और एक endothelial सेल, एक दूसरे के साथ प्रत्यक्ष शारीरिक संपर्क में सभी1, 5,9,10,11,12,13. एक intravasation द्वार के रूप में TMEM के समारोह के लिए महत्वपूर्ण घटना परिसंवहनी मैक्रोफेज14द्वारा अंतर्निहित पोत पर संवहनी endothelial विकास कारक (VEGF) के स्थानीयकृत रिलीज है. VEGF endothelial कोशिकाओं के बीच homotypic जंक्शनों को बाधित कर सकते हैं15,16,17 ,18,19, एक घटना है कि क्षणिक संवहनी रिसाव में परिणाम , भी के रूप में जाना जाता है “विस्फोट” पारगम्यता के रूप में IVI अध्ययन में वर्णित 5| TMEM मैक्रोफेज tyrosine kinase रिसेप्टर TIE2 व्यक्त करने के लिए दिखाया गया है, जो VEGF-मध्यस्थ TMEM समारोह के लिए आवश्यक है और perivascular आला करने के लिए इन मैक्रोफेज के homing5,20,21 , 22. कैंसर कोशिका प्रसार और मेटास्टेसिस को विनियमित करने के अलावा , TIE2+ मैक्रोफेज ट्यूमर एंजियोजेनेसिस21,22,23के केंद्रीय नियामकों के रूप में दिखाया गया है, 24,25,26,27,28,29,30,31. इस तरह के रूप में, TIE2+ मैक्रोफेज ट्यूमर microenvironment के एक महत्वपूर्ण घटक और metastatic झरना के मुख्य नियामक का प्रतिनिधित्व करते हैं.
बेहतर अवधारणा TMEM-मध्यस्थ संवहनी पारगम्यता (यानी “विस्फोट”), यह बहुत महत्वपूर्ण है यह संवहनी पारगम्यता के अन्य तरीकों से अलग है कि endothelial सेल सेल जंक्शनों के विघटन के साथ संबद्ध नहीं हैं. एक बरकरार एंडोथेलियम में (जिसके तंग और अनुयायी जंक्शनों को बाधित नहीं किया जाता है), संवहनी पारगम्यता के तीन मुख्य प्रकार हैं: (क) pinocytosis, जो हो सकता है, या नहीं, ingested सामग्री के transcytosis के लिए युग्मित किया जा सकता है; (ख) अंत:प्रर्णोदित फेन्स्स्ट्रा के माध्यम से सामग्री का परिवहन; और (ग) परकोशिकीय मार्ग के माध्यम से सामग्री का परिवहन, जो अंत:मंडलीय तंग जंक्शनों15,16,17,18,19,32 द्वारा विनियमित किया जाता है , 33 , 34. यद्यपि कई ट्यूमरों में अविनियमित, संवहनी पारगम्यता के उपर्युक्त साधनों का वर्णन अधिकांशत सामान्य ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान और होमियोस्टेसिस के संदर्भ में किया गया है, जिनमें से चरम सीमाएं या तो सीमित पारगम्यता के ऊतक हैं ( उदा., रक्त मस्तिष्क बाधा, रक्त-परीक्षण बाधा), या प्रचुर पारगम्यता (उदा., गुर्दे ग्लोमेरुलर उपकरण के fenestrated केशिकाओं)34,35,36,37.
multiphoton intravital इमेजिंग और बहुसंकेतित इम्यूनोफ्लोरेसी माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, हम TMEM-मध्यस्थ संवहनी पारगम्यता (“विस्फोट”) और स्तन ट्यूमर में संवहनी पारगम्यता के अन्य तरीकों के बीच अंतर करने में सक्षम हैं। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हम चूहों में एक उच्च आणविक वजन, फ्लोरोसेंट-लेबल जांच का एक भी अंतःशिरा इंजेक्शन प्रदर्शन करते हैं। सहज फट घटनाओं तो लाइव चूहों में intravital इमेजिंग का उपयोग कर कब्जा किया जा सकता है; या वैकल्पिक रूप से, जांच के extravasation रक्त vasculature के साथ सह-स्थानीयकरण अध्ययन द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए CD31+ या Endomucin+) और TMEM दरवाजे इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल इन तकनीकों, जो या तो स्वतंत्र रूप से या एक दूसरे के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है दोनों का वर्णन.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम दो प्रोटोकॉल है कि कल्पना और संवहनी पारगम्यता जो TMEM द्वार पर मौजूद है और संवहनी तंग और adherens जंक्शनों के विघटन के साथ जुड़ा हुआ है की एक विशिष्ट प्रकार की मात्रा निर्धारित करने के लिए लागू किया जा स…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इमेजिंग समर्थन के लिए अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन में विश्लेषणात्मक इमेजिंग सुविधा (एआईएफ) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। यह काम NCI से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (P30CA013330, CA150344, CA 100324 और CA216248), SIG 1S10OD019961-01, ग्रस-लिपर बायोफोटोनिक सेंटर और इसके एकीकृत इमेजिंग कार्यक्रम, और मोंटेफिओर के एल रुथ सर्जनT233 प्रशिक्षण ट्यूमर Microenvironment के अध्ययन के लिए (CA200561).
GSK सह पांडुलिपि लिखा, आंकड़ा 1C और 3B के लिए इमेजिंग प्रदर्शन किया, निश्चित ऊतक विश्लेषण प्रोटोकॉल विकसित की है, और विश्लेषण और सभी डेटा की व्याख्या; जेएमपी ने पांडुलिपि को सह-लिखा, और चित्रा 1 B,2C और 3A के लिए सर्जरी और इंट्राविटल इमेजिंग का प्रदर्शन किया; एलबी और एसी ने चित्रा 2 बी के लिए सर्जरी और इंट्राविटल इमेजिंग का प्रदर्शन किया; आरजे ने चित्रा 2A के लिए सर्जरी और इंट्राविटल इमेजिंग का प्रदर्शन किया; जेएससी ने पांडुलिपि को सह-लिखा और सभी डेटा का विश्लेषण और व्याख्या की; MHO सह पांडुलिपि लिखा है और विश्लेषण और सभी डेटा की व्याख्या; और डे ने चित्रा 2 डी के लिए सर्जरी और इंट्राविटल इमेजिंग का प्रदर्शन किया, पांडुलिपि को सह-लिखा, निश्चित ऊतक विश्लेषण और इंट्राविटल इमेजिंग प्रोटोकॉल विकसित किया, और सभी डेटा का विश्लेषण और व्याख्या की।
Materials
| Anti-rabbit IgG (Alexa 488) | Life Technologies Corporation | A-11034 | |
| Anti-rat IgG (Alexa 647) | Life Technologies Corporation | A-21247 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Citrate | Eng Scientific Inc | 9770 | |
| Cover Glass Slips | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Cyanoacrylate Adhesive | Henkel Adhesive | 1647358 | |
| DAPI | Perkin Elmer | FP1490 | |
| Dextran-Tetramethyl-Rhodamine | Sigma Aldrich | T1287 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Endomucin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | |
| Enrofloxacin | Bayer | 84753076 v-06/2015 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Fish Skin Gelatin | Fisher Scientific | G7765 | |
| Insulin Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| Isofluorane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Matrigel | Corning | CB40234 | Artificial extracellular matrix |
| Needle (30 G) | Becton Dickinson | 305128 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | PBS | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | |
| Pulse Oximeter | Kent Scientific | MouseOx | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Quantum Dots | Life Technologies Corporation | Q21561MP | |
| Rubber | McMaster Carr | 1310N14 | |
| TMR (primary antibody) | Invitrogen | A6397 | |
| Tween-20 | MP Biologicals | TWEEN201 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 184835 |
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