JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ricerca sul cancro

Bedömning tumör mikromiljö av metastaser Doorway-medierad vaskulär permeabilitet i samband med Cancer Cell spridning med Intravital avbildning och fast vävnads analys

Published: June 26, 2019
doi:
10.3791/59633
, , , , , , ,
1Department of Anatomy and Structural Biology,Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center,Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program,Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery,Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology,Montefiore Medical Center

Summary

Vi beskriver två metoder för att bedöma övergående vaskulär permeabilitet i samband med tumör mikromiljö av metastaser (TMEM) dörröppning funktion och cancer cell intravasation med hjälp av intravenös injektion av hög molekylvikt (155 kDa) dextran hos möss. Metoderna omfattar intravital avbildning i levande djur och fast vävnads analys med hjälp av immunofluorescens.

Abstract

Den vanligaste orsaken till cancerrelaterad dödlighet är metastaser, en process som kräver spridning av cancerceller från den primära tumören till sekundära platser. Nyligen, vi fastställt att Cancer Cell spridning i primär bröstcancer och vid metastaserande platser i lungorna sker endast vid dörröppningar kallas tumör mikromiljö av metastaser (TMEM). Tmem dörröppningen numrerar är prognostiska för avlägsen upprepning av metastaserad sjukdom i bröstcancer tålmodig. TMEM dörröppningar består av en cancer cell som över-uttrycker aktin reglerande proteinet Mena i direkt kontakt med en perivaskulär, proangiogen makrofage som uttrycker höga halter av TIE2 och VEGF, där båda dessa celler är tätt bundna till en blod kärl endotelcell. Cancerceller kan intravasate genom TMEM dörröppningar på grund av övergående vaskulär permeabilitet orkestreras av den gemensamma aktiviteten av TMEM-associerade makrofage och TMEM-associerade Mena-uttrycker cancer cell. I detta manuskript beskriver vi två metoder för bedömning av TMEM-medierad övergående vaskulär permeabilitet: intravital avbildning och fast vävnads immunofluorescens. Även om båda metoderna har sina fördelar och nackdelar, kombinera de två kan ge den mest kompletta analyser av tmem-medierad vaskulär permeabilitet samt kontrollerade förutsättningar för tmem funktion. Eftersom metastaserande process i bröstcancer, och möjligen andra typer av cancer, innebär Cancer Cell spridning via TMEM dörröppningar, är det viktigt att anställa väl etablerade metoder för analys av TMEM dörröppningen verksamhet. De två metoder som beskrivs här ger en övergripande strategi för analys av TMEM dörröppning aktivitet, antingen i naiva eller farmakologiskt behandlade djur, vilket är av största vikt för prekliniska prövningar av agenter som förhindrar cancer cell spridning via TMEM.

Introduction

Senaste framstegen i vår förståelse av cancermetastaser har upptäckt att epitelial till mesenkymala övergång (EMT) och induktion av en flytt/invasiv cancer cell subpopulation är inte, i sig, tillräckligt för hematogen spridning 1. faktum är att det tidigare trodde att och målriktad cancerceller intravasate genom hela cancer-associerade endotelet som tumören kärlnybildning kännetecknas ofta av låga pericytbiologi täckning, och som sådan, är mycket permeabel och instabilt2,3,4. Även om mycket suggestiva av defekta funktioner inom tumören, vaskulära modifieringar under carcinogenes ger inte bevis i sig att tumörceller kan tränga igenom blodkärlen lätt och på ett okontrollerat sätt. Insikter från intravital Imaging (IVI) studier, där tumörceller är fluorescerande-märkta och kärlsystemet är märkt via intravenös injektion av fluorescerande sonder (såsom dextran eller kvantprickar), visar att, medan tumör fartyg är jämnt permeabel till låg molekylvikt dextrans (e.g. 70 kD), hög molekylvikt dextrans (155 kD) och tumörceller kan korsa endotelet endast på specialiserade platser för intravasation som företrädesvis ligger vid vaskulär gren punkt5, 6 , 7. immunohistokemiska (IHC) analyser med hjälp av djurmodeller och Human patient-härledda material har visat att dessa platser är “dörröppningar” som specialiserat sig på att reglera vaskulär permeabilitet, lokalt och transitivt, vilket ger ett kort fönster av möjlighet för flyttande/invasiva cancerceller att komma in i cirkulationen. Dessa dörröppningar kallas “tumör mikromiljö av metastaser” eller “tmem”, och, ganska Expectedly, korrelerar deras densitet med en ökad risk att utveckla metastaserad sjukdom hos patienter med bröstcancer8,9, 10.

Varje TMEM dörröppning består av tre olika typer av celler: en perivaskulär makrofage, en tumör cell över-uttrycker aktin-reglerande protein däggdjur aktiverat (MENA), och en endotelcell, alla i direkt fysisk kontakt med varandra1, 5,9,10,11,12,13. Den viktigaste händelsen för funktionen av TMEM som en intravasation dörröppning är lokaliserad frisättning av vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) på det underliggande kärlet av perivaskulär makrofage14. VEGF kan störa homotypiska korsningar mellan endotelceller15,16,17,18,19, ett fenomen som resulterar i övergående vaskulära läckage, även känd som “sprängning” permeabilitet enligt IVI-studierna 5. Tmem makrofager har visat sig uttrycka tyrosinkinasreceptorn TIE2, vilket krävs för VEGF-medierad tmem funktion och homing av dessa makrofager till perivaskulär nisch5,20,21 , 22. Förutom att reglera spridningen av cancerceller och metastaser har TIE2+ makrofager visats vara centrala regulatorer av tumör angiogenes21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Som sådan, TIE2+ makrofager representerar en kritisk beståndsdel i tumören mikromiljö och huvud regulator av metastaserad kaskad.

För att bättre konceptualisera tmem-medierad vaskulär permeabilitet (dvs “sprängning”), är det mycket viktigt att skilja den från andra former av vaskulär permeabilitet som inte är förknippade med upplösningen av endotelceller cell-cell korsningar. I en intakt endotel (en vars snäva och anhängare korsningar inte störs), det finns tre huvudsakliga typer av vaskulär permeabilitet: (a) pinocytosis, som kan, eller inte kan, kopplas till transcytosis av det intagna materialet; b) transport av material genom endotelfenestrae. och (c) transport av material genom den paracellulära vägen, som regleras av endoteliala täta korsningar15,16,17,18,19,32 , 33 , 34även avreglerad i många tumörer, de ovan nämnda lägena av vaskulär permeabilitet har beskrivits främst i samband med normal vävnadfysiologi och homeostas, vars ytterligheter är vävnader med antingen begränsad permeabilitet ( t. ex., blod-hjärnbarriären, blod-testis barriär), eller riklig permeabilitet (t. ex., Fenestrated kapillärer av njure glomerulär apparat)34,35,36,37.

Använda multiphoton intravital avbildning och multiplexade immunofluorescensmikroskopi, kan vi skilja mellan tmem-medierad vaskulär permeabilitet (“sprängning”) och andra former av vaskulär permeabilitet i brösttumörer. För att uppnå detta, vi utför en enda intravenös injektion av en hög molekylvikt, Fluorescent-märkt sond i möss. Spontana sprängnings händelser kan sedan fångas med intravital avbildning i levande möss; Alternativt kan extravasering av sonden kvantifieras genom samtidig lokalisering studier med blodkärl (t. ex. CD31+ eller Endomucin+) och tmem dörröppningar med immunofluorescensmikroskopi. De protokoll som presenteras här beskriver båda dessa tekniker, som kan användas antingen självständigt eller tillsammans med varandra.

Protocol

Alla experiment som använder levande djur måste utföras i enlighet med djur användnings-och skötsel riktlinjer och föreskrifter. De förfaranden som beskrivs i denna studie genomfördes i enlighet med National Institutes of Health förordningar om vård och användning av försöksdjur och med godkännande av Albert Einstein College of Medicine djuromsorg och användning Kommittén (IACUC). 1. utvärdering av “sprudlande permeabilitet” med levande djur avbildning Transp…

Representative Results

De experimentella procedurer som beskrivs i denna protokolls artikel sammanfattas kortfattat och illustreras i figur 1A-C. För att mäta TMEM-medierad vaskulär permeabilitet (“sprängning aktivitet”) och för att minska experimentella buller från andra former av vaskulär permeabilitet (dvs. transcellulära och paracellulära, som förklaras i inledningen), vi utfört intravenös (i.v.) injektion av högmolekylära sonder, såsom 155 kDa dextra…

Discussion

Här skisserar vi två protokoll som kan tillämpas för att visualisera och kvantifiera en viss typ av vaskulär permeabilitet som finns på TMEM dörröppningar och är förknippad med störningar av vaskulära snäva och anhängare korsningar. Denna typ av vaskulär permeabilitet är övergående och kontrolleras av trepartsgruppen TMEM cell Complex, som förklaras ovan5. Förmågan att identifiera och kvantifiera TMEM-associerad vaskulär permeabilitet är avgörande för bedömningen av en Pr…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vill tacka analytisk Imaging Facility (AIF) i Albert Einstein College of Medicine för Imaging support. Detta arbete stöddes av bidrag från NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 och CA216248), SIG 1S10OD019961-01, den Gruss-Lipper Biophotonics Center och dess integrerade Imaging program, och Montefiore ‘ s Ruth L. Kirschstein T32 utbildning beviljande av kirurger för studiet av tumören mikromiljö (CA200561).

GSK skrev manuskriptet, utförde Imaging för figur 1c och 3b, utvecklade fast vävnads analysprotokoll och analyserade och tolkade alla data; JMP skrev manuskriptet och utförde operationen och intravital avbildning för figur 1b, 2C och 3a; LB & AC utförde operationen och intravital avbildning för figur 2b; RJ utförde operationen och intravital avbildning för figur 2A; JSC skrev manuskriptet och analyserade och tolkade alla data; MHO co-skrev manuskriptet och analyserade och tolkade alla data; och de utförde operationen och intravital avbildning för figur 2D, co-skrev manuskriptet, utvecklat fast vävnad analys och intravital Imaging protokoll, och analyserade och tolkade alla data.

Materials

Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Ricerca sul cancro. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42 (2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112 (2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Ricerca sul cancro. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Ricerca sul cancro. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75 (2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Ricerca sul cancro. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271 (2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

Tags

Tumor MicroenvironmentTMEMVascular PermeabilityCancer Cell DisseminationIntravital ImagingDextranTumor TransplantationMacrophagesMammary Fat PadExtracellular MatrixTail Vein Catheter
check_url/it/59633?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Karagiannis, G. S., Pastoriza, J. M., Borriello, L., Jafari, R., Coste, A., Condeelis, J. S., Oktay, M. H., Entenberg, D. Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis. J. Vis. Exp. (148), e59633, doi:10.3791/59633 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image