이중 루시파라제 기자 시스템을 통해 포유류 세포에서 CRISPR 플라스미드 의 건설 및 녹아웃 효율 검출
Summary
여기서, CRISPR 효소와 관련 단일 가이드 RNA(sgRNAs)를 모두 발현하는 플라스미드의 효율적인 생성을 위한 간소화된 방법을 설명하는 프로토콜을 제시한다. 이 sgRNA/CRISPR 벡터와 이중 루시파라제 리포터 벡터를 결합하여 포유류 세포의 공동 배빙을 통해 녹아웃 효율을 평가할 수 있습니다.
Abstract
비록 매우 효율적이지만 CRISPR 효소에 의한 게놈 부위를 수정하려면 표적 부위에 고유한 sgRNA 생성이 사전에 필요합니다. 이 작업은 DNA 염기서열 분석 전에 PCR에 의한 양성 식민지를 효율적으로 검출할 수 있는 전략을 사용하여 효율적인 sgRNA 벡터의 시공으로 이어지는 주요 단계를 설명합니다. CRISPR 시스템을 이용한 효율적인 게놈 편집에는 매우 효율적인 sgRNA가 필요하기 때문에 시간과 노력을 절약하기 위해 후보 sgRNA 표적을 사전 선택해야 합니다. 이중 루시파라제 기자 시스템은 단일 가닥 어닐링을 통해 이중 가닥 브레이크 수리를 검토하여 녹아웃 효율성을 평가하기 위해 개발되었습니다. 여기서, 우리는 특정 유전자 편집을 위한 후보 sgRNA 벡터로부터 선호하는 xCas9/sgRNA 표적을 픽업하기 위하여 이 리포터 시스템을 이용합니다. 설명된 프로토콜은 10일 안에 바람직한 sgRNA/CRISPR 효소 벡터를 제공할 것이다(적절하게 설계된 올리고뉴클레오티드로 시작).
Introduction
CRISPR sgRNA는 게놈 표적 서열1,2에상보적인 20-뉴클레오티드 서열(protospacer)을 포함한다. 매우 효율적이지만, CRISPR/Cas 시스템이 주어진 게놈 부위를 수정할 수 있는 능력은 대상 부위(들)에 고유한 효율적인 sgRNA를 운반하는 벡터의 생성을 필요로한다 2. 이 백서는 sgRNA 벡터 생성의 주요 단계를 설명합니다.
CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 성공적인 게놈 편집을 위해 고효율 sgRNAs를 사용하는 것은 중요한 전제 조건3,4,5입니다. 게놈 편집에 사용되는 엔지니어링 뉴클레아제는 상이한 표적 로시1에서다양한 효율성을 나타내기 때문에, 시간과 노력을 절약하기 위해 후보 sgRNA 표적의 사전 선택이 필요하다6,7,8,9. 이중 루시파라제 기자 시스템은 단일 가닥 어닐링3,10을통해 이중 가닥 브레이크 수리를 검사하여 녹아웃 효율을 평가하기 위해 개발되었습니다. 여기서 우리는 특정 유전자 편집을 위해 설계된 상이한 후보 sgRNA 벡터로부터 선호하는 CRISPR sgRNA 표적을 선택하기 위해 이 리포터 시스템을 사용합니다. 여기에 명시된 프로토콜은 CRISPR sgRNA를 생성하고 평가하기 위해 지난 몇 년 동안 우리 그룹과 협력 실험실에서 구현되었습니다.
다음 프로토콜은 네트워크 소프트웨어를 통해 적합한 sgRNA를 설계하는 방법을 요약합니다. 적합한 sgRNA가 선택되면, 우리는 pX330-xCas9 발현 벡터에 쌍을 이루는 올리고뉴클레오티드를 삽입하기 위한 접근법뿐만 아니라 필요한 올리고뉴클레오티드를 얻기 위한 상이한 단계를 설명한다. 또한 이러한 시퀀스의 결찰에 기초하여 sgRNA-표현 및 이중 루시파제 리포터 벡터를 조립하는 방법을 미리 소화된 발현 벡터로 조합한다(단계 2-10, 도 1A). 마지막으로 각 sgRNAs(11-12단계)에 대한 DNA 절단 효율을 분석하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리가 여기서 설명한 sgRNA 벡터 복제 절차는 올리고뉴클레오티드 주문 및 벡터 시퀀싱에서 파생된 대부분의 비용으로 sgRNAs의 효율적인 생산을 용이하게 합니다. 설명된 방법은 사용자가 CRISPR/Cas9와 함께 사용하기 위해 sgRNA를 생성할 수 있도록 설계되었지만, 프로토콜은 Cas9 정형소또는 Cpf1과 같은 다른 RNA 유도 엔도넬리스와 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있으며 벡터 백본 및 올리고뉴클레…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 중국 국립 자연과학 재단(31301936)의 중국 산둥성 일류 초원 과학 징계 프로그램에 의해 지원되었습니다. 31572383), 공익농업과학연구특별기금(201403071), 우유 제품 품질 및 안전의 국가 위험 평가 주요 특별 프로젝트(GJFP201800804) 및 칭다오 인민생계과학기술 프로젝트(19-6-1-68-nsh, 14-45-25-25-25-45-25-25-45-25-25-25-45-25-45-25-45-25-45-45-45-25-45-25-45-25-45-25-25-45-25-45-45-25-45-25-25-45-25-45-25-25-25-25-45-25-25-45-25-45-25-45-25-45-25-25-45-25-45-45-45-25-25-25-25-45-25-25-25-45-45-45-25-25-25-45-25 13-1-3-88-nsh).
Materials
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
Riferimenti
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