Costruzione di plasmidi CRISPR e rilevamento dell'efficienza knockout nelle cellule di mammifero attraverso un sistema Dual Luciferase Reporter
Summary
Qui presentiamo un protocollo che descrive un metodo semplificato per la generazione efficiente di plasmidi che esprimono sia l’enzima CRISPR che l’RNA a guida singola associato (sgRNA). La co-trasfezione delle cellule di mammifero con questo vettore sgRNA/CRISPR e un vettore reporter a doppia luciferasi che esamina la riparazione della rottura a doppio filamento consente la valutazione dell’efficienza knockout.
Abstract
Sebbene altamente efficiente, la modifica di un sito genomico da parte dell’enzima CRISPR richiede in anticipo la generazione di uno sgRNA unico per il sito o i siti di destinazione. Questo lavoro descrive i passaggi chiave che portano alla costruzione di vettori sgRNA efficienti utilizzando una strategia che consente il rilevamento efficiente delle colonie positive da parte della PCR prima del sequenziamento del DNA. Poiché un editing efficiente del genoma utilizzando il sistema CRISPR richiede uno sgRNA altamente efficiente, è necessaria una preselezione degli obiettivi di sgRNA candidati per risparmiare tempo e fatica. È stato sviluppato un sistema di reporter a doppia luciferasi per valutare l’efficienza del knockout esaminando la riparazione della rottura a doppio filamento tramite ricottura a singolo filamento. Qui, usiamo questo sistema reporter per raccogliere il target xCas9 / sgRNA preferito dai vettori sgRNA candidati per l’editing genico specifico. Il protocollo delineato fornirà un vettore enzimatico sgRNA/CRISPR preferito in 10 giorni (a partire da oligonucleotidi opportunamente progettati).
Introduction
Gli sgRNA CRISPR comprendono una sequenza di 20 nucleotidi (il protospazio), che è complementare alla sequenza bersaglio genomica1,2. Sebbene altamente efficiente, la capacità del sistema CRISPR/Cas di modificare un determinato sito genomico richiede la generazione di un vettore che trasporta uno sgRNA efficiente unico per il sito o i siti di destinazione2. Questo documento descrive i passaggi chiave nella generazione di quel vettore sgRNA.
Per un corretto editing del genoma utilizzando il sistema CRISPR/Cas, l’uso di sgRNA altamente efficienti è unprerequisito cruciale 3,4,5. Poiché le nucleasi ingegnerizzate utilizzate nell’editing del genoma manifestano diverse efficienze a diversi locimirati 1,è necessaria una preselezione degli obiettivi di sgRNA candidati al fine di risparmiare tempo efatica 6,7,8,9. È stato sviluppato un sistema di reporter a doppia luciferasi per valutare l’efficienza del knockout esaminando la riparazione della rottura a doppio filamento tramite ricottura asingolo filamento 3,10. Qui usiamo questo sistema reporter per scegliere un target di sgRNA CRISPR preferito da diversi vettori sgRNA candidati progettati per l’editing genico specifico. Il protocollo qui indicato è stato implementato nel nostro gruppo e laboratori di collaborazione negli ultimi anni per generare e valutare gli sgRNA CRISPR.
Il seguente protocollo riassume come progettare sgRNA adatti attraverso il software di rete. Una volta selezionati gli sgRNA adatti, descriviamo i diversi passaggi per ottenere gli oligonucleotidi richiesti e l’approccio per inserire gli oligonucleotidi accoppiati nel vettore di espressione pX330-xCas9. Presentiamo anche un metodo per assemblare vettori reporter di sgRNA-expressing e dual luciferase basati sulla legatura di queste sequenze in un vettore di espressione predigerito (passaggi 2-10, Figura 1A). Infine descriviamo come analizzare l’efficienza di taglio del DNA per ciascuno degli sgRNA (passaggi 11-12).
Protocol
Representative Results
Discussion
Le procedure di clonazione vettoriale dello sgRNA che abbiamo descritto qui facilitano la produzione efficiente di sgRNA, con la maggior parte dei costi derivati dall’ordinamento oligonucleotide e dal sequenziamento vettoriale. Mentre il metodo delineato è progettato per consentire agli utenti di generare sgRNA da utilizzare con CRISPR /Cas9, il protocollo può essere facilmente adattato per l’uso con ortologhi Cas9 o altre endonucleasi guidate da RNA come Cpf1, introducendo piccole modifiche alla dorsale vettoriale e a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato dal First Class Grassland Science Discipline Program della Provincia di Shandong (Cina), National Natural Science Foundation of China (31301936, 31572383), il Fondo speciale per la ricerca agrosci scientifica nell’interesse pubblico (201403071), la valutazione nazionale del rischio, il principale progetto speciale di qualità e sicurezza dei prodotti lattiero-caseari (GJFP201800804) e i progetti di scienza e tecnologia del sostentamento delle persone di Qingdao (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).
Materials
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
Riferimenti
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