Строительство плазмидов CRISPR и обнаружение эффективности нокаутов в клетках млекопитающих с помощью системы репортеров Dual Luciferase
Summary
Здесь мы представляем протокол, описывающий обтекаемый метод эффективного поколения плазмидов, выражающей как фермент CRISPR, так и связанные с ним одногидные РНК (sgRNAs). Ко-трансфекции клеток млекопитающих с этим вектором sgRNA/CRISPR и двойной вектор люциферазы репортер, который рассматривает двойной прядь перерыв ремонт позволяет оценку эффективности нокаута.
Abstract
Несмотря на высокую эффективность, модификация геномного участка ферментом CRISPR требует заранее генерации sgRNA, уникальной для целевого участка. В этой работе описаны ключевые шаги, ведущие к строительству эффективных векторов sgRNA с использованием стратегии, которая позволяет эффективно обнаруживать положительные колонии ПЦР до секвенирования ДНК. Поскольку эффективное редактирование генома с использованием системы CRISPR требует высокоэффективной sgRNA, предварительный отбор кандидатов sgRNA целей необходимо, чтобы сэкономить время и усилия. Двойная система репортер luciferase была разработана для оценки эффективности нокаута путем изучения двойной пряди перерыва ремонт через одну прядь annealing. Здесь мы используем эту систему репортеров, чтобы подобрать предпочтительную цель xCas9/sgRNA от векторов кандидата sgRNA для конкретного редактирования генов. Протокол, изложенный обеспечит предпочтительный вектор фермента sgRNA/CRISPR в течение 10 дней (начиная с надлежащим образом разработанных олигонуклеотидов).
Introduction
SgRNAs CRISPR состоит из 20-нуклеотидной последовательности (протопространственника), которая дополняет геномную целевуюпоследовательность 1,2. Несмотря на высокую эффективность, способность системы CRISPR/Cas изменять данный геномный сайт требует генерации вектора, несущего эффективную sgRNA, уникальную для целевого сайта(ы) 2. В настоящем документе описаны ключевые шаги в генерации этого вектора sgRNA.
Для успешного редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas использование высокоэффективных sgRNAs является важнейшимусловием 3,4,5. Так как инженерии нуклеазы, используемые в редактировании генома проявляется разнообразная эффективность на различных целевыхлокусов 1, предварительный отбор кандидатов sgRNA целей необходимо для того, чтобысэкономить время и усилия 6,7,8,9. Двойная система репортер luciferase была разработана для оценки эффективности нокаута, изучая двойной пряди перерыв ремонт через одну прядь annealing3,10. Здесь мы используем эту систему репортеров, чтобы выбрать предпочтительную цель CRISPR sgRNA из различных векторов sgRNA кандидата, предназначенных для конкретного редактирования генов. Протокол, заявленный здесь, был реализован в нашей группе и сотрудничающих лабораториях в течение последних нескольких лет для создания и оценки CRISPR sgRNAs.
Следующий протокол подводит итоги, как разработать подходящую sgRNA через сетевое программное обеспечение. После выбора подходящих sgRNAs мы описываем различные шаги для получения необходимых олигонуклеотидов, а также подход к вставке парных олигонуклеотидов в вектор выражения pX330-xCas9. Мы также представляем метод для сборки sgRNA-экспрессии и двойной люциферазы репортер векторов на основе перевязки этих последовательностей в препереваренный вектор выражения (шаги 2-10, рисунок 1A). Наконец, мы описываем, как проанализировать эффективность сокращения ДНК для каждого из sgRNAs (шаги 11-12).
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанные здесь процедуры клонирования вектора sgRNA облегчают эффективное производство sgRNAs, при этом большая часть затрат приходится на заказ олигонуклеотида и секвенирование векторов. В то время как изложенный метод предназначен, чтобы позволить пользователям генерировать sgRNAs для и?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект финансировался программой научной дисциплины первого класса Grassland провинции Шаньдун (Китай), Национальным фондом естественных наук Китая (31301936, 31572383), Специальный фонд агронау научных исследований в общественных интересах (201403071), Национальный проект по оценке рисков качества и безопасности молочной продукции (GJFP201800804) и проекты науки и техники жизнедеятельности населения Циндао (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).
Materials
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
Riferimenti
- Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042 (2018).
- Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).
- Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
- Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair. Cell. 142 (4), 646 (2010).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).
- Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Ruan, J., et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs. Scientific Reports. 5, 14253 (2015).
- Li, K., et al. An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance. China patent. , (2012).
- Li, H., et al. Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels. Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).
- Li, H., et al. A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene. China patent. , (2015).
