Qui, presentiamo la microscopia a forza atomica (AFM), operata come strumento di nano- e micro-rientranza su cellule e tessuti. Lo strumento consente l'acquisizione simultanea della topografia della superficie 3D del campione e delle sue proprietà meccaniche, tra cui il modulo della parete cellulare Young e la pressione del turgor.
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Articolo metodologico
Uso della microscopia a forza atomica per misurare le proprietà meccaniche e la pressione del turgor delle cellule vegetali e dei tessuti vegetali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Qui presentiamo l'uso della microscopia a forza atomica per far rientrare i tessuti delle piante e recuperare le sue proprietà meccaniche. Utilizzando due diversi microscopi in modalità di rientro, mostriamo come misurare un modulo elastico e usarlo per valutare le proprietà meccaniche della parete cellulare. Inoltre, spieghiamo anche come valutare la pressione del turgor. I principali vantaggi della microscopia a forza atomica sono che è non invasiva, relativamente rapida (5-20 min), e che praticamente qualsiasi tipo di tessuto vegetale vivente superficialmente piatto può essere analizzato senza la necessità di trattamento. La risoluzione può essere molto buona, a seconda della dimensione della punta e del numero di misure per unità di area. Una limitazione di questo metodo è che dà solo accesso diretto allo strato di cellule superficiali.
Introduzione
La microscopia a forza atomica (AFM) appartiene alla famiglia di microscopia a sonda a scansione (SPM), dove una punta con un raggio di solito di pochi nanometri scansiona la superficie di un campione. Il rilevamento di una superficie non si ottiene tramite metodi ottici o basati su elettroni, ma tramite le forze di interazione tra la punta e la superficie del campione. Pertanto, questa tecnica non si limita alla caratterizzazione topografica di una superficie campione (risoluzione 3D che può scendere a pochi nanometri), ma consente anche la misurazione di qualsiasi tipo di forza di interazione come l'elettrostatica, van der Waals o forze di contatto. Inoltre, la punt....
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Protocollo
1.Misura delle proprietà meccaniche delle pareti cellulari
NOT: Viene presentato un esempio del gynoecium in via di sviluppo dell'Arabidopsis.
- Preparazione dei campioni biologici
- Raccogliere un bocciolo di fiore chiuso allo stage 9 a 10 (circa 0,5 mm di lunghezza) in base alle fasi pubblicate determinazione per Arabidopsis4. Sotto un binocolo, utilizzando belle pinzette, aprire con attenzione il germoglio per controllare la fase di sviluppo e raccogliere il gynoecium situato al centro del fiore.
- Mettere il gynoecium su nastro doppio lato posto....
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Risultati
Figura 1A e Figura 1B mostra una schermata che illustra il risultato dei passaggi da 1.3.4 a 1.3.6 del protocollo, utilizzato per individuare un'area di interesse in cui acquisire la mappa di QI. Vale la pena ricordare che la regione di interesse è stata scelta per non essere su una superficie inclinata (cioè il più piatta possibile). In realtà, come notato da Routier et al.5, se l'asse di rientro non è pe.......
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Discussione
L'emergere di forme nelle piante è determinato principalmente dal tasso coordinato e dalla direzione della crescita nel tempo e nello spazio. Le cellule vegetali sono racchiuse in una parete cellulare rigida fatta di una matrice polisaccartide, che le incolla insieme. Di conseguenza, l'espansione cellulare è controllata dall'equilibrio tra la pressione del turgor che tira sulla parete cellulare e la rigidità della parete cellulare che resiste a questa pressione. Al fine di comprendere i meccanismi alla base dello svilupp.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il team PLATIM per il supporto tecnico, arezki Boudaoud e i membri del team Biophysic presso il laboratorio RDP per le discussioni utili.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Crescita media | |||
| 1.000x soluzione | utilizzata per produrre ACM, composizione vedi Stanislas et al., 2017. Aggiungere all'ACM dopo la sterilizzazione in autoclave, prima di versare. | ||
| Acido 1-N-naftilftalamico (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | aggiungere al terreno Arabidopsis, 10 μM. Aggiungere dopo la sterilizzazione in autoclave, prima di versare. |
| Agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | aggiungere ad Arabidopsis medium, 1% p/v. |
| Agarosio | Merck Millipore | 9012-36-6 | utilizzato per produrre ACM solido, 0,8% p/v. |
| Arabidopsis terreno | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | Per coltura in vitro di arabidopsis, 11,82g/L. |
| Nitrato di calcio tetraidrato | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | aggiungere al terreno Arabidopsis, 2 mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Miscela di sali basali, utilizzata per fare ACM, 2,2 g/ L. |
| N6-benziladenina (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | usato per produrre ACM, 555 nM. Aggiungere all'ACM dopo la sterilizzazione in autoclave, prima di versare. |
| Oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | per il trattamento con oryzalin, 10 μ g/mL. |
| Miscela per la conservazione delle piante (PPM) | delle cellule vegetali | utilizzata per produrre ACM, 0,1% v/v. Aggiungere all'ACM dopo la sterilizzazione in autoclave, prima di versare. | |
| Idrossido di potassio | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | utilizzato per produrre il terreno Arabidopsis e l'ACM, entrambi con pH 5,8. |
| Saccarosio | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | utilizzato per produrre ACM, 1% p/v. |
| Tools per AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | L'AFM utilizzato per la misurazione della pressione del turgore in questo protocollo. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | L'AFM utilizzato per misurare le proprietà meccaniche. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Struttura elasitica di riferimento | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | colla biocompatibile. |
| Punte AFM sferiche | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Punte utilizzate per misurare le proprietà meccaniche. |
Riferimenti
- Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
- Dumais, J.
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Ristampe e permessi
