Santral hücreleri ve bitki dokularının mekanik özelliklerini ve Turgor basıncını ölçmek için Atomic Force Microkopi kullanımı

Summary

Burada, hücre ve dokularda nano ve mikro girinti aracı olarak işletilen atomik kuvvet mikroskobu (AFM) sunuyoruz. Cihaz, numunenin 3D yüzey topografisini ve hücre duvarı Young 'ın modüllerinin yanı sıra Turgor basıncını da içeren mekanik özelliklerini eşzamanlı olarak satın almayı sağlar.

Abstract

Burada atom kuvveti mikroskobu kullanımı bitki dokularına girinti ve mekanik özelliklerini kurtarmak için sunuyoruz. Girintileme modunda iki farklı mikroskopları kullanarak, bir elastik modülün nasıl ölçüleceği ve hücre duvarının mekanik özelliklerini değerlendirmek için nasıl kullanılacağını gösteririz. Buna ek olarak, Turgor basıncını nasıl değerlendireceğiz de açıklanmaktadır. Atomik kuvvet mikroskopinin ana avantajları, non-invaziv, nispeten hızlı (5 ~ 20 dakika) ve yüzeysel olarak düz olan yaşam bitki dokusunun neredeyse her türlü tedaviye gerek kalmadan analiz edilebilir olmasıdır. Çözünürlük, uç boyutuna ve birim alanı başına ölçüm sayısına bağlı olarak çok iyi olabilir. Bu yöntemin bir sınırlama sadece yüzeysel hücre katmanına doğrudan erişim sağlar olmasıdır.

Introduction

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tarama prob mikroskobu (SPM) ailesine aittir, genellikle birkaç nanometrelerin yarıçapı olan bir uç bir numunenin yüzeyini tarar. Bir yüzeyin tespiti, optik veya elektron bazlı yöntemlerle değil, uç ile örnek yüzey arasındaki etkileşim güçleri aracılığıyla elde edilmez. Böylece, bu teknik örnek bir yüzeyin topografik karakterizasyonu ile sınırlı değildir (birkaç nanometreye kadar gidebilir 3D çözünürlük), aynı zamanda elektrostatik, Van der Waals veya kontak kuvvetleri gibi etkileşim kuvvetlerinin her türlü ölçümünü sağlar. Ayrıca, uç biyolojik bir numunenin yüzeyine kuvvet uygulamak ve ortaya çıkan deformasyonu ölçmek için kullanılabilir, sözde "girinti", mekanik özelliklerini belirlemek için (örneğin, Young 's modulus, viskoelastik özellikleri).

Bitki hücresi duvarlarının mekanik özellikleri, gelişim süreçlerinin temelindeki mekanizmaları anlamaya çalışırken dikkate alınması gerekli olan^1,2,3. Nitekim, bu özellikleri sıkıca geliştirme sırasında kontrol edilir, hücre duvar yumuşatıcı hücrelerin büyümesine izin vermek için gerekli olduğundan özellikle. AFM, bu özellikleri ölçmek ve organlar, dokular veya gelişimsel aşamaları arasında değişme şeklini incelemek için kullanılabilir.

Bu yazıda, hem hücre duvarı mekanik özelliklerini hem de Turgor basıncını ölçmek için AFM 'nin nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bu iki uygulama iki farklı AFM mikroskoplar üzerinde gösterilmiştir ve sonra burada ayrıntılı olarak gösterilmektedir.

Protocol

1. ölçü hücre duvar mekanik özellikleri

Not: Arabidopsis 'in gelişmekte olan dokunaçlarını örneği sunulmuştur.

1. Biyolojik numunelerin hazırlanması
   1. Arabidopsis⁴için yayınlanan aşamaları belirlenmesine göre 9 ila 10 (yaklaşık 0,5 mm uzunluğunda) aşamasında kapalı bir çiçek tomurcuk toplayın. Bir binoküler altında, ince Cımbız kullanarak, dikkatle geliştirme aşamasını kontrol etmek ve çiçek merkezinde bulunan dokunaçlarını toplamak için tomurcuk açın.
   2. Küçük bir petri tabağı (5 cm çapı) kapağının ortasına yerleştirilen çift taraflı teyp dokunaçlarını koyun.
      Not: Alternatif olarak, biyouyumlu tutkal da girintileme üzerine numunenin daha verimli immobilizasyonu için kullanılabilir.
   3. Numune tamamen kapılana kadar hızla su ekleyin. Bu, dehidrasyon önler ve örnek için ucu yapışma azaltır. Alternatif olarak, örneğin Arabidopsis Apex kültür orta⁵gibi sıvı ortamda örnek daldırın.
2. AFM kalibrasyonu
   1. Örnek yüzeyin istenilen girintileme kadar deformasyonuna izin verecek kadar yüksek, ancak hassasiyet kaybını önlemek için çok yüksek olmayan, konsol Yay sabiti k değerini ayarlayın.
      Not: Başparmak kaba bir kural olarak, Eğer genç modülünün örnek biliniyorsa, bahar sabiti büyüklüğü sırası k≈E * δolarak seçilebilir, burada δ istenilen girintileme olduğunu.
   2. 15 μm uç-konsol mesafesine sahip R = 400 nm küresel uçlu uç kullanın.
      Not: Uç yarıçapı doğrudan lateral çözünürlüğe bağlı. Genellikle, biyolojik malzemelerin girintileme için, yuvarlak ipuçları seçin (R büyüktür 10-20 Nm) veya kolloidal problar. Küçük kolloidal problar, örnek yüzeye dokunabilir uç ucu ve konsol arasındaki küçük mesafe nedeniyle kullanmak zor olabilir.
   3. Yazılımı açın ve kafa yatay olarak en az 2-3 h deneme önce yerleştirin: Bu termalize baş sağlayacak ve termal kaynaklı konsol-lazer göreli hareketler kaçınacaktır. Mikroskop bir CellHesion modülü ile donatılırsa (kullanılabilir Z piezo aralığını 15 μm yerine 100 μm ' ye uzatarak), önce kumandasını açın ve ardından yazılımı başlattığınızda CellHesion modunu seçin.
   4. Cam blok üzerinde konsol Mount ve kafasına blok monte. Ucu suya daldırılır zaman hava kabarcıkları oluşumunu önlemek için ucu ultra saf su birkaç mikrolitresindeki bir damlacık yerleştirin.
   5. Sabit bir örnek (temizlenmiş cam slayt veya safir) yerleştirin ve 30-50 μL ultra saf su ekleyin.
      Not: Burada açıklanan kalibrasyon prosedürü, bazen denilen kontak kalibrasyonuyla aynıdır. İlk olarak, sert ve düz bir yüzeyde bir kuvvet eğrisi yapılır ve daha sonra Yay sabiti hesaplamak için ısı heyecanlı konsol osilasyon spektrum kaydedilir. Diğer kalibrasyon protokolleri var ve kısaca tartışma paragrafında tarif edilecektir.
   6. Başını sahneye yerleştirin (Z motorlarını yeterince yüksek kaldırmamaya dikkat edin). Lazer konsol üzerinde kabaca yerleştirmek için optik görüntü kullanın.
      1. Lazeri, fotodiyot üzerindeki toplam sinyali izleyen ana eksen boyunca hareket ettirin.
         Not: Standart konsol kullanıldığında, 0,5 V 'den büyük bir toplamı elde edilmelidir.
      2. Lazer diğer yönde hareket ettirin ve konsol ortasında lazer konumlandırmak için toplam sinyali maksimize. Bu yan ve dikey saptırma arasındaki çapraz konuşma en aza indirmek olacaktır.
   7. Saptırma hassasiyetinin ölçülmesi
      Not: Fotodiyot Lazer Deplasman okur ve voltlar bir sinyal sağlar. Metrik ünitede sapmayı ölçmek için saptırma hassasiyeti ölçülmelidir.
      1. Kontak → Force spektroskopisindecihazı ayarlayın. Bağıl bir ayar noktası olarak 2 V, z uzunluğa 0,5 μm olarak ayarlayın ve hızı 2 μm/s 'ye (örnekleme hızı 10000 Hz) uzatır ve Z kapalı döngüsünüseçin.
      2. Kalibrasyon yöneticisini açın ve doğrusal bir uyum sağlamak için kuvvet eğrisinin (doğrusal olması gereken) temas parçasını seçin: eğim tersi saptırma hassasiyetini verir. Fotodiyot okuma artık metrik ünitede kalibre edilmiştir.
   8. Bahar sabiti belirlenmesi. Kalibrasyon Yöneticisi'nde, bir termal spektrum edinme çalıştırmak için bahar sabiti seçin. Sinyali daha uzun bir süre için Ortalama olarak, ∞ sembolünü seçin. Termal heyecanlı konsol güç spektrumunun çeşitli doruklarına gösterebilir; sığması için en düşük frekansa yerleştirilen bir seçim çizin.
      Not: Termal Tune sıvı olarak gerçekleştirildiğinde rezonans zirvesinde daha geniş olacaktır ve frekans nominal bir seviyeye göre azaltılır.
3. Kuvvet spektroskopisi deneme kurma ve edinme
   1. Numuneyi AFM aşamasına yerleştirin ve kafası numunenin üzerine yerleştirin.
      Not: Baş ve örnek yüzey arasında sert bir temas önlemek için yeterince geri çekildiğinden emin olun.
   2. İzin ver, birkaç dakika boyunca termalize edelim.
   3. QI modu, 50 nn bir SetPoint kuvvet ile yaklaşım.
   4. 4 μm ' lik bir Z uzunluğu ve 80 x 80 μm² ' ye kadar bir tarama alanı ile 40 x 40 ' e kadar bir dizi piksel ayarlayın. Gelişmiş görüntüleme ayarları panelinde, modu sabit hızda ayarlayın. Hızı 200 μm/s ve numune oranlarına 25 kHz 'e uzatır ve geri çekin.
   5. Taramayı başlatın ve örnek hareket ederse kontrol etmek için bu hızlı düşük kuvvet tarama kullanın. Taranan alanın enkaz veya deflected hücrelerden serbest olduğunu doğrulayın ve ölçümleri gerçekleştirmek için olabildiğince düz bir ilgi bölgesini bulun.
      Not: Gerçek numune eğimini takdir etmek için, hat seviyelendirme kapalı veya sabitolarak ayarlanmalıdır. Girintileme ekseni ile yüzey arasındaki aşırı eğim açısı, ölçülen Young modülü⁵üzerinde bir etkiye sahip olacaktır.
   6. Bir ilgi alanı bulunduktan sonra, 40 x 40-60 x 60 μm² civarında bir bölge seçin ve 2 piksele/μm ' ye ulaşmak için piksel numarasını artırın. 500 mil girintileme elde etmek Gerekirse, denemenin başlangıcında bu değeri ayarlayın. Z uzunluğunu 2 μm ' ye azaltın. 100 μm/s hızına uzatmayı ve geri çekilmeyi azaltın ve numune hızını 50 kHz 'e yükseltin.
   7. Taramayı başlatın ve çıktıyı kaydedin (genellikle bir görüntü ve veri dosyası tarafından oluşur).
   8. Ölçüm günün sonunda, uç tutucuyu çıkarın ve ultra saf su ve% 70 EtOH ile yavaşça durulayın.
   9. Kuru ve konsol çıkarın. Aynı ucu ile daha fazla deneyler için, bir ıslak temizleme protokolü ile temizlik düşünün ve mümkünse, bir takip plazma O₂ tedavi. Tuz kristalizasyonu önlemek için su, konsol ve/veya ucu tutucu üzerinde kuru izin vermeyin.
4. Veri Analizi (6. x veri Işleme yazılımı sürümü için)
   1. Veri Işleme yazılımını açın ve veri dosyasını yükleyin.
   2. Haritanın tüm eğrileri üzerinde aynı analiz parametrelerini kullanmak için toplu işleme düğmesi için bu haritayı kullanın tıklayın.
   3. Önceden tanımlanmış yük Işleminde Hertz Sığdır'ı seçin.
   4. Kalibrasyon parametrelerini doğrulamak veya değiştirmek için ilk sekmeyi kullanın.
   5. İkinci sekmede, ortalama değerini 0 olarak ayarlamak için bir uzaklığı (veya ofset artı bir eğim) taban çizgisine kaldırın.
   6. Üçüncü sekmede, uzatma eğrisi boyunca ayar noktası değerinden geldiğinde 0 kuvvetini geçen ilk nokta olarak dikkate alarak ilgili kişi (POC) konumunu tahmin edin.
   7. Sekme Dikey ipucu konumu , yükseklik ölçülmesi 'nden konsol sapmasını çıkararak ipucu hareketini hesaplar. Bu adımda, ilgili onay kutusunu işaretleyerek aşağıdaki Sığdır için Unsmoothed yüksekliği (ham veri) kullanın.
   8. Elastikiyete Sığdır sekmesinde, uygun uyum modelini seçin. Geri eğrilerinde hiçbir veya zayıf yapışma görünüyorsa (ayar noktası kuvvetinin% 10 ' dan az veya seçili girinti derinliğinde en fazla ortalama kuvvet için karşılık gelen), model türü Hertz/Sneddon olarak ayarlanmalıdır ve eğrinin kullanılması gerekir. Güçlü yapışma durumunda, DMT modeli, Derjaguin-Muller-Toporov modeli için standları, tercih edilmelidir ve sığar eğriler üzerinde yapılmalıdır (mevcut kontakt modelleri ve ilgili formüller hakkında ayrıntılar için manuel bakın).
      1. Nominal uç şekline göre ipucu geometrik parametrelerini ayarlayın. Burada, Ipucu şekli küre ve ucu Radius 400 nm olduğunu.
      2. Biyolojik malzeme (sıkıştırılamaz malzemeye karşılık gelen) için geleneksel olarak yapılır gibi 0,5 için Poisson oranı ayarlayın.
   9. Belirli girintileme kadar sığdır. Varsayılan olarak, sığdır tüm eğri üzerinde gerçekleştirilir. Sığdır belirli bir girintileme kadar yapılması gerekiyorsa, önce Shift Curve onay kutusunu işaretleyin; Bu, yeni belirlenen temel ve POC değerlerine dayalı olarak eğri kaynağını kaydıracaktır.
      1. Ana pencerede simgeye tıklayarak ikinci bir elastikiyet Sığdır rutin ekleyin.
      2. Tüm uyum parametrelerini yeniden ayarlayın ve istenen Girintiyi X min olarak belirtin. POC konumunun belirlenmesini ve daha sonra hesaplanan girinti derinliğini iyileştirmek için gerekli sayıda adım (2 ila 3 adım yeterli olmalıdır) ekleyin. Bu noktada işlem kaydedilebilir.
   10. Tıklayın tutmak ve tüm eşleme tüm eğrileri üzerinde önceki adımları yinelemek için uygulayın.
   11. Sonuçları kaydedin. Bir görüntü ve. tsv dosyaları elde edilecektir.

2. Turgor basıncı ölçüsü

Not: Arabidopsis 'in oryzalin tedavi edilen çiçeklenme meristem bir örnek sunulmuştur.

1. Biyolojik numunenin hazırlanması
   1. Toplamak Arabidopsis çiçeklenme meristem (IM) in vitro bağlanırlar gelen mikrotubule depolymerizing ilaç oryzalin ile orta Polar oksin vardır taşıma inhibitörü 1-N-naphthylphthalamic asit (NPA) yayımlanan yöntemi aşağıdaki içeren yetiştirilen ⁶' ya kadar.
   2. İki seçenekten birini izleyerek ım örneği montaj
      1. Uzun süreli izleme için: numuneyi, kontaminasyonu önlemek için Arabidopsis Apex kültür ortamı (ACM)^7,8 ve 0,1% bitki koruma karışımı (ppm) içeren petri-dish içinde bağlayın. ACM yüzeyinin üstündeki anlık ileti ucunu askıya alın ve 2% agarose bir damla ile ım tabanı destek.
      2. Hızlı çözelti değişimleri ile ölçüm için: örnek bir petri-tabak yapışkan mastik küçük bir parça tutarak monte ve hızlı bir şekilde biyolojik uyumlu tutkal ile mastik ve numune tabanı arasındaki boşluğu mühürlemek. Tutkal (2 dk daha az), daha sonra% 0,1 ppm içeren sıvı ACM içinde örnek daldırın kuvvetlendirmek bekleyin.
         Not: Numune tabanının sabitlenmesi sırasında örnek yüzeyin agaroz veya tutkal ile kaplanmamış olduğundan emin olun. Turgor basıncının AFM ölçümü, numunenin istikrarlı bir şekilde monte edilmesini gerektirir ve önceki montaj yöntemleri kabul edilebilir stabilite sağlar. Örneğe bağlı olarak, Çift taraflı teyp, poli-lizin vb. gibi diğer montaj yöntemleri kullanılabilir.
2. AFM kalibrasyonu
   1. AFM edinme yazılımını açın ve Peakforce QNM (büyük genlik) ölçüm modunu seçin.
   2. 2,1 ile 2,6 arasındaki adımlarda açıklanan aynı ilkeyi izleyerek kalibrasyon gerçekleştirin.
   3. Denetim parametreleri penceresinde, Tarama boyutu 0 olarak ayarlayın. Rampa penceresinde, 200 nm ile 500 Nm arasında rampa boyutunu ayarlayın, 2 v Ile 5 v arasında Trig eşik ve 2048 veya daha yüksek numune sayısı .
   4. Kalibrasyon örneği ile konsol ucunu hizalayın ve yaklaşımıtıklayın.
   5. Temas üzerine, rampa penceresine gidin ve düğme sürekli rampatıklayın. Eğrinin doğrusal rejiminde, güncelleme duyarlılığı düğmesine tıklayarak eğimi belirleyin. Sapma hassasiyeti ölçümünü birkaç kez tekrarlayın ve menü kalibrasyonundan sekme dedektörünü açarak kalibrasyonu ölçüm ortalaması ile manuel olarak güncelleyin .
   6. AFM kafasını geri çekin ve kalibrasyon örneğini çıkarın.
      Not: Tamamen örnek değişikliği üzerine kazara sert temas önlemek için sekme sahne → Initialize seçerek AFM başını geri çekmek için önerilmektedir.
3. Kuvvet spektroskopisi deneme kurma ve edinme
   1. Örnek henüz daldırın değilse, ppm içeren sıvı ACM ile alt birleştir.
   2. Edinme yazılımında, ölçüm parametrelerini aşağıdaki gibi belirtin:
      1. Kontrol parametresi penceresinde, bahar sabiti için konsol üretilen Yay sabiti veya belirlenen yay sabiti olarak adım 2,8 olarak ayarlayın. Bu örnekte, 42 N/m 'de ayarlanır.
      2. Bu örnekte uç yarıçapı 400 nm 'ye ayarlayın.
      3. Set örnek Poisson oranı 0,5 için, su ağırlıklı olarak Turgor basıncı katkıda beri.
      4. Set Sample/Line 128 hızlı edinme sağlamak için.
      5. Tarama hızını 0,2 Hz 'ye ayarlayın.
      6. Tarama boyutunu 1 μm olarak ayarlayın.
         Not: Tarama hızını ve küçük tarama boyutunu ayarlamak, AFM tarama tetikleyen örnek hasarı etkili bir şekilde engelleyebilir. Herhangi bir örnek değişiklik üzerine bu iki parametre azaltma önerilir.
      7. Rampa penceresinde, rampa boyutunu 5 μm olarak ayarlayın.
         Not: Daha iyi temel edinme için daha iyi ayar rampa boyutu amaçlanan girinti derinliği daha büyük.
      8. Trig eşiğini maksimuma ayarlayın.
      9. 4608 için numune sayısını ayarlayın.
      10. İsteğe bağlı olarak, mikroskop → nişan parametreleri sekmesinde, güçlü temas kaynaklı örnek hasarı önlemek için aşağıdaki parametreleri azaltın. Ayarlar Peak Force Engage SetPoint 0,3 v (varsayılan 0,5 v) için. 0,5 (varsayılan 0,75) için Engage Int. Gain ayarlayın. Set SPM 4 μm (varsayılan 15 μm) adımına girerler.
   3. Örneği AFM kafası altında yerleştirin ve hizalayın ve konsol batana kadar yaklaşın, örnek yüzeye temas etmeyin.
      Not: Yaklaşan iken, hafifçe sıvı ACM yüzeyinde darbe bir sıvı köprü olarak konsol ve sıvı yüzey arasında meydana kadar. Bu genellikle sert temas önler.
   4. Bakım ile, elle örnek doğru yaklaşım. Prob nispeten örnek yüzeye yakın olduğunda, yaklaşım' ı tıklatın.
   5. Temas üzerine, kademeli olarak Tarama boyutu ve/veya tarama oranı örnek ve/veya konsol zarar vermeden istenen bir denge kadar artırın.
      Not: Tarama boyutu, numunenin yüzey eğriliği ve pürüzlülüğü ile sınırlıdır. Oryzalin-tedavi ım durumunda, 50 x 50 μm² tarama alanı 0,3 Hz tarama hızı ile elde edilebilir.
   6. Tarama sırasında ölçüm bölgesinin istediğiniz gibi olup olmadığını belirleyin. Gerekirse yeniden konumlandırın. Memnun zaman, düğme noktası ve ateş nokta ve ateş penceresi başlatmak için tıklayın.
   7. Taraması kaydetmeden önce, hücre konturlarını net bir şekilde tanımlamanıza olanak sağlayan uygun bir görüntü kanalı seçin. Genellikle, tepe kuvvet hatası, DMT modulus, LogDMT Modulus veya dağılımı uygundur. Dizin ve dosya adını kaydet belirtin. Sonra kayıt başlatmak için sonraki tarama rampa tıklayın.
      Not: Bir nokta ve üç sayı bir dize otomatik olarak atanan dosya adından sonra eklenir (gibi. 000). Bu sayı, kaydedilmiş her tarama tekrarı üzerine 1 ile otomatik olarak artar.
   8. Tarama tamamlandığında, yazılım arayüzü otomatik olarak Ramp penceresine yönlendirilecektir. Girintili pozisyonları belirtmek için taranan resme tıklayın.
      Not: Girintileri kaydetmeden önce, parametre değişimi gerekliyse ( rampa boyutu, piezo pozisyonu, vb.), sadece Ramptıklayarak test girintileri gerçekleştirmek için birkaç simge seçimi daha iyi olur. Girinti derinliği hücre duvar kalınlığından daha büyük olması gerekir (ideal olarak iletim elektron mikroskobu tarafından ayrı olarak belirlenir).
   9. Barycenter yakınındaki hücre başına en az üç girinti sitesi seçin ve girinti, site başına üç kez yineleyin. Bu daha fazla analiz için hücre başına en az dokuz kuvvet eğrileri verim. Girinti site yerleşimi ile memnun olduğunuzda, rampa ve yakalama'yı tıklatın. Kuvvet girintileme eğrileri otomatik olarak belirlenmiş dizine kaydedilir.
   10. Rampalar tamamlandığında, döşeme ölçümü için farklı bir konuma konumlandırın veya tarama kafasını geri çekin ve örneği değiştirin.
   11. Bittiğinde, adımları 1.3.8 ve 1.3.9 olarak konsol temizleyin.
4. Veri Analizi
   1. Analiz yazılımında, *. MCA dosyasını açın. Bu, taranan görüntüde her kuvvet eğrisinin konumunu gösterir. İstenirse, analiz için kuvvet eğrilerini önceden seçin.
   2. Genellikle x0000y. 00Zbiçiminde analiz edilecek bir kuvvet eğrisini açın, burada x, y ve z Dizin kaydetme dizininde belirtilen dosya adıdır ve girinti sırası ve tarama numarasını belirten otomatik olarak kaydedilir.
   3. Temel düzeltme düğmesini tıklatın ve kaynak taban çizgisi başlangıcını Genişlet ve kaynak temel durağının % 0 ve 80% olarak genişletilinceye kadar kuvvet eğrisindeki mavi tire satırlarını sürükleyin. ' I tıklatın Execute.
      Not: Alternatif olarak, kaynak taban çizgisi durmasını Genişlet , hala taban çizgisi içinde olduğu ve ilgili kişi noktasının ötesinde olmadığı sürece farklı değerlerde ayarlanabilir.
   4. Boxcar filtre düğmesini tıklatın ve düzgün kuvvet eğrisi için Yürüt ' ü tıklatın.
   5. Girinti düğmesini tıklatın.
      1. Giriş penceresinde, etkin eğri genişletmekiçin ayarlayın.
      2. Fit yöntemini Doğruyma modeline ayarlayın ve Evet'e yapışma kuvveti ekleyin .
      3. Maksimum kuvvet sınırını % 99 ve Min kuvvet sığdır sınırına % 75 olarak ayarlayın.
      4. Sığdır modelini sertliği (doğrusal) olarak ayarlayın.
         Not: Bu kurulum, Turgor basınç kesintisi için belirgin sertlik k hesaplayacaktır. Bu örnekte, fit sınırları yaklaşık 1,5 μm girintileme derinliğine uygun bir sertlik yansıtmaktadır.
   6. Kuvvet eğrileri toplu olarak analiz edilebilir. Çalışma geçmişi düğmesini tıklatın, rapor dizinini belirtin ve aynı işlemi gerektiren diğer tüm kuvvet eğrilerini ekleyin. Memnun olduğunda, Çalıştır' ı tıklatın. Varsayılan olarak, sığdır *. txt dosyası olarak depolanır.
   7. K toplu monte edildiğinde, girinti penceresine dönmek için History → 5 girintileme seçeneğini tıklatın.
      1. % 10 ve Min Force fit sınırına % 0 ' a kadar maksimum kuvvet sınırı değiştirin.
      2. Fit modelini hertzian 'a (küresel) ayarlayın.
         Not: Bu hücre duvarı Hesaplamalı genç 'in modüus E Turgor basınç kesintisi için. Bu örnekte, uygun sınırlar yaklaşık 0,4 μm girintileme derinliğinin Hertzian uyum (küresel prob kullanarak) yansıtır.
   8. Eiçin toplu uyum için adım 2.4.6 yineleyin.
   9. Farklı tarama kanallarını görüntülemek için *. 00Z dosyasını (z otomatik olarak kayıtlı tarama numarasıdır) açın. Yükseklik kanalı penceresinde bölüm düğmesi 'ni tıklatın. Bu, Turgor basınç kesintisi için gerekli olan numunenin yüzey eğriliği ölçümüne izin verecektir.
      1. Bir hücrenin uzun ekseni boyunca bir çizgi çizin, çizgi çizgi sınırlarını hücre kenarlarına taşıyın ve RADIUS değeri r₁' i kaydedin. R₂yarıçapı almak için kısa eksen için bunu tekrarlayın. Hücrenin yüzey ortalama eğrilik κ_M ve Gauss eğriliği κ_G iki yarıçapın ölçümü aşağıdaki gibi kullanarak hesaplayın:
         Ve 
   10. Deduce Turgor basınç P ⁹ yayımlanan ince kabuk modelini kullanarak aşağıdaki gibidir:
        
       Ile
       
       nerede t hücre duvar kalınlığı örneğin elektron mikroskobu tarafından belirlenir.
       Not: Turgor basıncının kesintisi, yinelemelerin gerekli olduğu uygun bir süreçtir. Dört yineleme genellikle istikrarlı ürün yeniden oluşturabilirsiniz, ancak daha fazla yineleme yapılabilir (örneğin 100 kez).
   11. Hücre başına ortalama E, k ve P hesaplayın. Ayrıca, belgeler için hücre içi değişkenliği (örn. standart sapma) kaydedin.

Representative Results

Şekil 1a ve Şekil 1B , QI haritasını elde etmek için ilgi alanı bulmak için kullanılan protokolün 1.3.6 için bir adım, 1.3.4 adımlarının sonucunu gösteren bir ekran görüntüsü gösterir. Bu ilgi bölgenin (yani, mümkün olduğunca düz) eğimli bir yüzey üzerinde olmak için seçilmiş olduğu söz eder. Aslında, routier ve al.⁵tarafından fark edilirken, girinti ekseni yüzeye dik değilse, Young 'ın ölçüm modülü hafife alınabilir. Bu efekt, hücrelerin kenarlığının bir bölümünün hücrenin geri kalanından daha yumuşak göründüğünden, Şekil 1' in C veya D panellerinin sağ üst köşesinde görülebilir. Bu etkiye bağlı eserler, yerel Tilt açısının 50 x 50 μm² tarama alanı üzerinden 40 ° ' ye kolayca aşabileceği meristemler durumunda çok daha güçlü olacaktır. Laboratuvarımızda, şu anda bu eserler (hazırlık kağıt) düzeltmek için, routier ve al.⁵tarafından açıklanan yaklaşım dayalı bir algoritma geliştiriyoruz. Şekil 1C ve Şekil 1D Show Young 'ın modül haritaları, protokolün dördüncü paragrafında ayrıntılı olarak analiz edildikten sonra elde edilmiştir. Özellikle, C paneli, Kullanıcı tanımlı kuvvet ayar noktasına kadar tüm girintileme analizi yapılan Young 'ın modülünü temsil ederken, panel D, girintinin ilk 100 Nm analizinin sonucunu gösterir (adım 1.4.9 ' de açıklandığı gibi). Burada, 2 haritalar son derece benzer görünüyor, çünkü deneme seti sırasında, ayar noktası 100 Nm civarında ortalama girintileri elde etmek için seçilmiştir. Analiz girintisi varyasyonu bazen daha iyi vurgulamak örnek heterojenikler yol açabilir, bu konumu tanımlamak için veya iç yapıların davranışını hakkında bilgi sağlamak için yararlı olabilir (örneğin, Costa ve al.¹⁰)

Şekil 2 ' deki kuvvet eğrisi, bahsetmeye değer iki efekti gösterir. Her şeyden önce, Eğer kuvvet eğrisi yaklaşım parçası aslında 500 nN, aşağı uç hareketi devam ediyor, uç tarafından uygulanan son kuvvet anlamı (burada 1.000 nN) beklenenden daha yüksek olan set noktası kuvvetinde biter fark edilebilir. Bunun nedeni, konsol sapmasını izleyen geri besleme döngüsünün anında hareket etmediğini, bu nedenle sonlu reaksiyon süresi saptırma eşik algılama ve piezo hareket durdurma arasında bir gecikme sunar. Ayrıca, özellikle örnek tutucuyu taşıyan CellHesion kullanırken, hareketli parçaların ataleti oyuna girer ve bu zaman gecikmeyi daha uzun hale gelir. Bu sorun baş piezo kullanarak sınırlı olabilir, bu durumda Kullanıcı çok kaba veya eğimli örneklerde ölçümler durumunda gerçekten dikkatli olması gerekir, ya da zaten çözünürlüğü ve/veya tarama örneklerinin sayısını sınırlar rampa hızını azaltarak ( Ayrıca çok yavaş haritalar için, örnek büyüyen bir sorun olabilir). Genellikle, kuvvet eğrileri birbirlerinden yeterince uzaksa (seçimin girinti modeline dayanarak, girintili alanın yarıçapı girintileme derinliğine göre hesaplanabilir ve minimum ayırma mesafesi olarak kullanılırsa), farklı bir örnek boyunca pozisyonlar korelasyon olmamalıdır ve analiz yaklaşım eğrisi üzerinde gerçekleştirildiğinde, kuvvet eşik üstesinden bir sorun olmamalıdır. Her neyse, Eğer örnek hassas veya tekrarlanan taramalar aynı alanda yapılır, bilim adamı bu overshoot en aza indirmek için denemek isteyebilirsiniz. Ne yazık ki, bu overshoot miktarını belirlemek için başparmak bir kural değil, kullanılan piezo bağlıdır beri, rampa hızları üzerinde, ama aynı zamanda malzeme özellikleri: sert malzeme, zaman içinde saptırma sinyalinin daha hızlı varyasyonu ve , bir sonlu geribildirim yanıt süresi verilen, yüksek overshoot.

İkinci şey fark etmek elips tarafından vurgulanan geri eğrisi üzerinde sallayarak olduğunu. Bu tür sallayarak örnek hareket/uç eylem altında titreşimli bir göstergesi olabilir. Bu durumda, Kullanıcı taranan alanı değiştirmeye deneyebilirsiniz (bazen mikroskop başka bir parçası ama ipucu örnek dokunabilir, ya da örnek yeterince iyi desteğine sabit olabilir) veya örnek birkaç aynı destek üzerinde hazırlanmış. Bu özellik her zaman orada ise, bu durumda çift taraflı teyp sabitleme biyouyumlu yapıştırır geçiş sabitleme yöntemi değiştirmek daha iyidir.

Şekil 3 , Turgor basınç kesintisi için anahtar parametrelerin belirlenmesini gösterir. Her parametre, hücre duvar kalınlığı hariç¹¹ hangi ayrı olarak Elektron Mikroskopisi tarafından belirlendiği ~ 740 nm, AFM taramaları ve girintileri alınabilir. Adım 2.4.10 sığdırma sürecinin ardından, bu kuvvet eğrisi için 1,50 MPa olmak üzere Turgor basıncı düşürülür. Bu hücredeki tüm onsekiz kuvvet eğrilerini havuz E = 6,77 ± 1,02 MPA, k = 14,18 ± 2,45 N/m ve P = 1,45 ± 0,29 MPa (Mean ± standart sapma) ortalama değerleri verir.

Şekil 1 : Genellikle bir deneme sırasında elde edilen topografi haritaları (yükseklik ölçülen). (A) Taranacak uygun bir bölgeyi bulmak için ilk düşük çözünürlük/düşük kuvvet Haritası kaydedilir. (B) Young 'ın modülü (Siyah noktalı kare tarafından vurgulanan alanda) hesaplanması için daha küçük bir yüksek çözünürlüklü/daha yüksek kuvvet haritası elde edilir. (C) genç 'in modülü haritaları, 1,4 adımda ayrıntılı olarak B haritasına göre hesaplanır. Burada, Young 'ın modülü haritası her güç eğrisinde tüm girintileme Analizi elde edilmiştir. (D) Young 'ın modülü haritası yalnızca ilk 100 girintileme nm analizinde elde edilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2 : Kuvvet eğrisi örneği. Mavi yaklaşım, kırmızı geri çekilme segmenti. Maksimum kuvvet (geri tepme eğrisinde bulunan), sonlu geri besleme döngüsü reaksiyon süresi ve atalet nedeniyle kuvvet ayar noktasından farklıdır. Geri eğrisi içinde sallayarak destek örnek fikrasyon bir eksikliğin temsilcisi olabilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 3 : Turgor basınç kesintisi Için AFM ölçümleri. (A) DMT modülüyle harita, hücre barycenter yakınında derin girinti sitelerin konumlandırma denetlemek için net hücre kontur gösterir. Girinti siteleri haç ile işaretlenir. (B) Aiçinde kırmızı haç pozisyonunda derin girintileme eğri. Hücre duvarı Young 'ın modülü E (yeşil) ve örnek belirgin sertlik k (kırmızı) adım 2,4 ayrıntılı olarak eğri farklı rejimlerde donatılmıştır. R ² uygun belirlenmesi katsayısı gösterir. (C) yükseklik Haritası el ile belirlenen uzun ve kısa eksenleri ile, beyaz çizgiler tarafından tasvir, aynı hücrenin panellerde analiz a ve B. (D) panel C hücresinin uzun ve kısa eksenlerinin yükseklik profili (mavi, uzun eksen kırmızı, kısa eksen) ve sokaklar d eğrilik yarıçapları (r₁ ve r₂). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Discussion

Bitkilerin şekillerin ortaya çıkması esas olarak zaman ve uzay sırasında koordine oranı ve büyüme yönü ile belirlenir. Bitki hücreleri, onları bir araya yapıştıran bir polisakkaridik matrisden yapılmış sert bir hücre duvarında kaplı. Sonuç olarak, hücre genişleme hücre duvarı çekerek Turgor basıncı arasındaki denge tarafından kontrol edilir, ve bu basınca dayanıklı hücre duvarının sertlik. Kalkınma temel mekanizmaları anlamak için, farklı dokularda veya belirli bir organ hücrelerinde hem hücre duvarı mekanik özellikleri hem de Turgor basıncı ölçmek muktedir önemlidir. Bu yazıda gösterildiği gibi, AFM bu bağlamda seçim yöntemidir.

Protokolde birkaç kritik adım vardır. Birincisi, dehidrasyon önlemek için yeterince hızlı olmalıdır doku hazırlama. Biz Turgor basıncı ölçmek istiyorsanız bu özellikle kritik olabilir. Çok önemli aynı zamanda substrat için örnek doğru bir fiktasyon: kararsız bir örnek kolayca optik olarak tespit edilebilir bir makroskopik hareket gibi çok belirgin etkilere yol açabilir, ya da kuvvet eğrileri güçlü bir deformasyonu. Her neyse, örnek titreşim veya bükme sonuçları içine eserler tanıtmak, algılamak için ince olabilir. Son olarak, başka bir kritik adım girinti parametrelerinin seçiminde ilgilidir. Bu sonuçların kalitesi için belirleyici olduğunu.

Büyük alanlarda (40-50 μm ' den fazla tarama boyutu) mekanik özellikleri ölçerken, yükseklik farklılıkları yüksek olabilir ve Z piezo aralığının sınırına ulaşmadan yüzeyi düzgün bir şekilde takip etmek ve kuvvet eğrileri gerçekleştirmek zor hale gelmiştir. Bu sorunun üstesinden gelmek için bir CellHesion modülü kullanılmıştır. Bu modül ek bir Z piezo ekler, örnek aşamaya bulunan, bir 100 μm aralığı olan, tehlikeli Z piezo limitleri yaklaşmadan büyük alanlar edinme sağlar.

Yöntemin ilk sınırlaması sadece yüzeysel hücre katmanlarını ölçebiliriz. Ancak, son yazarlar doku bölümleri üzerinde AFM kullandık^12,13,14. Bu sabit malzeme üzerinde yapılması gerekir rağmen, derin hücre katmanlarının mekanik özelliklerine erişim verebilirsiniz. Alternatif olarak, uzamsal çözünürlüğe daha büyük kurban verdikçe, yaşam örneklerinde iç dokuların mekanik özelliklerini anlamak için daha derin girintiler de yapılmıştır. İkinci bir sınırlama örnek geometriye bağlanabilir, dik bir eğim olan bir yüzey, İpucu örnek için daha dik olmadığından sorunlu olabilir. Biz içinde önlemler güvenilir ve şu anda bu fenomen ile bağlantılı potansiyel eserler düzeltmek için bir algoritma geliştiriyoruz açıları aralığını kısıtlamak gerekir. Ayrıca, bazı dokular ölçümleri engelleyebilirsiniz trichomes ile kaplıdır. Son olarak, girinti hücre yüzeyi ile ilgili dikey yönde mekanik özellikleri ölçer ve bu kolayca büyüme kapasitesine ilişkili hücre duvarı genişletilebilirlik bağlı olabilir eğer merak edebilirsiniz. Çeşitli çalışmalar bu durumda^15,16olduğunu düşündürmektedir.

Burada AFM tarafından kuvvetlerin ölçümü/uygulanması hakkında daha genel bir gözlem yapmaya değer. Protokol bölümünde açıklandığı gibi, fotodiyot üzerindeki lazer kesimlerini kuvvetlere dönüştürebilmek için bir kalibrasyon yapılmalıdır. Bu kalibrasyona bir parametre, saptırma hassasiyeti, lazer yer değiştirmelerini gerçek konsol sapmasına (genellikle nm cinsinden ölçülür) dönüştürebilir, bu nedenle bu faktör fotodiyot çıkış gerilimlerini (dikey eksenler boyunca) kalibre eder ve Nm. İkinci faktör Yay sabiti K, N/m ölçülür, hangi güç ünitelerinde dikey konsol defleksiyonları dönüştürür (genellikle nn), esnek atölyeler yaylar gibi davranır beri. Prosedür basit görünüyorsa bile, işlemin farklı adımlarını etkileyebilen farklı hata kaynakları nedeniyle AFM Force spektroskopisi ölçümleri için K 'nin sağlam ve tekrarlanabilir kalibrasyonu hala bir sorundur. Örneğin, sert bir yüzeyde bir kuvvet eğrisini gerçekleştiren saptırma hassasiyetinin ölçümü, uçlu yüzeyde ise yanlış değerlere yol açabilir veya yüzey mükemmel bir şekilde temizlenmez ya da yüzey şarjı elektrostatik repulsiyon ortaya atarsa. Önceki durumlarda, kuvvet eğrisinin temas kısmı deforme olur (doğrusal yerine daha fazla eğimli veya kavisli).

Protokol bölümünde açıklanan ilgili kişi prosedürü, mevcut birkaç kalibrasyon yordamının sadece bir tanesi. Nispeten kolay ve ucuz bir şekilde kullanılabilecek en az 2 daha fazla yöntem vardır: sader yöntemi (bazı AFM yazılımında uygulanırken temas dışı olarak da adlandırılır) veya referans konsol yöntemi. Sader yöntemi¹⁷ aslen V şeklindeki konsol Için John sader tarafından geliştirilen ve daha sonra dikdörtgen olanlar için¹⁸ ve sert bir substrat bir kuvvet eğrisi satın alınması gerekmez. Bunun yerine, Kullanıcı (iletişim yöntemi olarak sıcaklık dışında) belirtmek gerekir, uzunluğu ve konsol genişliği ve konsol (genellikle hava, su veya su benzeri sıvılar) olduğu sıvının yoğunluğu ve viskozitesi. Sonra bir termal spektrum elde edilir ve hem saptırma hassasiyeti hem de Yay sabiti ölçülür. Bu yöntem, sert bir substrat üzerinde bir kuvvet eğrisi yaparken zarar görmüş olabilir çok keskin veya işlevselleştirilmiş ipuçları kullanırken avantajlı.

Her iki önceki Yöntemler, termally-heyecanlı bir konsol osilasyon spektrumunun satın alınması ile ilgilidir. Sert konsol oda sıcaklığında kullanıldığında, ortalama osilasyon genliği 0,1 Nm 'den daha düşük olabilir, rezonans zirvesinde daha küçük ve tespit edilmesi daha zor hale gelir. Her neyse, en azından bu yazıda kullanılan her iki enstrüman için, rezonans zirvesinde aslında hava ve suda tespit edilebilir ve Yay sabiti ölçmek için monte edilebilir (ölçüm sıvıyla yapıldığı zaman, rezonans frekansı daha düşük doğru vardiya değerleri ve tepe genişleştirir).

Üçüncü bir yöntem, bir termal Tune kullanmaz, ancak bunun yerine bir referans konsol veya referans elastik yapısı, bilinen bir bahar sabiti ile (genellikle yaklaşık veya% 5 altında bir belirsizlik ile), konsol Kbelirlemek için. Bu durumda, saptırma hassasiyetini ölçmek için sert bir substrat üzerinde ilk kuvvet eğrisi elde edilmesi gerekir (Bu da eğri şeklini etkileyen tüm olası eserler ile birlikte tekrar gelir). Daha sonra sert substrat referans konsol ile değiştirilir (genellikle kalibreli bir yay sabiti ile ucu-Less konsol) ve başka (veya birkaç diğerleri) kuvvet eğrisi gerçekleştirilir, tekrar saptırma hassasiyeti değeri kayıt. Konsol Yay sabiti aşağıdaki gibi hesaplanır:

K_ref referans Cantilever Yay sabiti olduğu, s_ref üzerinde ölçülen saptırma hassasiyeti, L uzunluğu ve S_sert sabit üzerinde ölçülen sapma hassasiyeti Substrat. ΔL , referans konsol ucunu ve sonu arasındaki uzaklık ve Kullanıcı tarafından yapılan hizalamaya bağlıdır ve sonunda α, AFM üreticisi tarafından belirtilen konsol eğim açıdır. Aynı yöntem, özel olarak konsol veya ındenter kalibrasyonu için tasarlanmış elastik yapılarda kullanılabilir. Bu yapıların avantajı (genellikle dairesel) onların merkezinde K sabit ve herhangi bir geometrik parametre veya onlara AFM ucu kesin konumlandırma bağlı değildir, bu yüzden kaldırma l ve Δl önceki formülden.

AFM Kullanıcı tüm bu kalibrasyon yöntemleri farklı hata kaynaklarından etkilendiğini akılda tutmak zorunda (ilk ve üçüncü saptırma duyarlılığı belirlenmesi, ilk ve ikinci ve geometrik için sert konsol durumunda termal Tune kullanımı parametre ve üçüncü için hizalama yanı sıra referans konsol K_ref kalibrasyon doğruluğu kullanılır) ve bu kontak yöntemleri potansiyel uç için zararlı (özellikle üçüncü, burada kalibrasyon iki kullanımını uygular farklı örnekler). Bu, bahar sabiti her zaman belirli bir hassasiyete kadar belirlenecek ve böylece ölçülen/uygulanan kuvvetler olacaktır anlamına gelir (bkz: Sikora¹⁹ farklı kalibrasyon yöntemleri ve onların hassasiyetinin kapsamlı bir inceleme için. Bu, Young 'ın Moduli ve Turgor basınçları da konsol kalibrasyonuyla etkilenecek anlamına gelir. Her neyse, bu miktarlarda hesaplanırken diğer daha da önemli hata kaynakları yer alan (genç modülünün belirlenmesi için Basitleştirilmiş modellerin kullanımı gibi) bu nedenle her zaman bu tür ölçümler dışında mutlak değerler elde etmek için bir meydan okuma olacaktır. Önemli olan, büyüklüğü doğru düzende olan ve birbirleriyle tutarlı olan değerleri elde etmektir, yani deneme aynı örnek üzerinde aynı kullanıcı tarafından tekrarlanırsa, değerlerin uyumlu olması gerekir. Bunu elde etmek için kalibrasyon dikkatle yapılmalıdır ve hata kaynaklarının minimize edilmesi gerekir (örneğin, muhtemelen akustik gürültü/titreşimler kadar sınırlama). Tekrarlanan kalibrasyonların tutarlılık artırmaya odaklanan olası bir strateji, son zamanlarda Schillers ve al.²⁰tarafından yapılan bir yazıda, 11 Avrupa laboratuvarının işbirliği sayesinde, bir protokol (Snap olarak adlandırılır) ile hataları telafi etmek için eğilme hassasiyeti belirlenmesi geliştirilmiştir. Bu yazıda yazarlar kendi ölçümleri için doğrudan kalibre atölyeler kullanmak, yine de aynı protokol non-kalibre atölyeler uygulanabilir, sadece seçim yöntemi ile ilk kez kalibre ve daha sonra ilk bahar göz önünde bulundurarak ("kalibre edilmiş") değeri olarak sabittir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth medium
1,000x vimatin stock solution			used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)	Sigma-Aldrich/Merck	132-66-1	add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring.
Agar-agar	Sigma-Aldrich/Merck	9002-18-0	add to Arabidopsis medium, 1% w/v.
Agarose	Merck Millipore	9012-36-6	used to make solid ACM, 0.8% w/v.
Arabidopsis medium	Duchefa Biochimie	DU0742.0025	For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.
Calcium nitrate tetrahydrate	Sigma-Aldrich/Merck	13477-34-4	add to Arabidopsis medium, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM	Duchefa Biochimie	M0221.0025	Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L.
N6-benzyladenine (BAP)	Sigma-Aldrich/Merck	1214-39-7	used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Oryzalin	Sigma-Aldrich/Merck	19044-88-3	for oryzalin treatement, 10 μg/mL.
Plant preservation mixture (PPM)	Plant Cell Technology		used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Potassium hydroxide	Duchefa Biochimie	1310-58-3	used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.
Sucrose	Duchefa Biochimie	57-50-1	used to make ACM, 1% w/v.
Tools for AFM
BioScope Catalyst BioAFM	Bruker		The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.
Nanowizard III + CellHesion	JPK (Bruker)		The AFM used for measuring mechanical properties.
Patafix	UHU	D1620
Reference elasitic structure	NanoIdea	2Z00026
Reprorubber-Thin Pour	Flexbar	16135	biocompatible glue.
Spherical AFM tips	Nanoandmore	SD-SPHERE-NCH-S-10	Tips used for measuring mechanical properties.