In Vivo Avanti Schermo Genetico per Identificare Nuovi Geni Neuroprotettivi in Drosophila melanogaster
Summary
Vi presentiamo un protocollo utilizzando un approccio genetico in avanti allo screening per i mutanti che mostrano neurodegenerazione in Drosophila melanogaster. Incorpora un saggio di arrampicata, analisi istologica, mappatura genica e sequenziamento del DNA per identificare in ultima analisi nuovi geni legati al processo di neuroprotezione.
Abstract
C’è molto da capire sull’insorgenza e la progressione delle malattie neurodegenerative, compresi i geni sottostanti responsabili. Lo screening genetico in avanti utilizzando mutageni chimici è una strategia utile per mappare i fenotipi mutanti ai geni tra la Drosophila e altri organismi modello che condividono le vie cellulari conservate con gli esseri umani. Se il gene mutato di interesse non è letale nelle fasi iniziali dello sviluppo delle mosche, è possibile eseguire un’analisi in aumento per esaminare gli indicatori fenotipici del funzionamento del cervello in diminuzione, come i bassi tassi di arrampicata. Successivamente, è possibile eseguire un’analisi istologica secondaria del tessuto cerebrale per verificare la funzione neuroprotettiva del gene segnando fenotipi di neurodegenerazione. Le strategie di mappatura genica includono la mappatura meiotica e di carenza che si basa su questi stessi assegni può essere seguita dal sequenziamento del DNA per identificare possibili cambiamenti nucleotidi nel gene di interesse.
Introduction
I neuroni sono per la maggior parte post-mitotici e incapaci di dividere1,2. Nella maggior parte degli animali, esistono meccanismi neuroprotettivi per mantenere queste cellule per tutta la durata della vita dell’organismo, soprattutto in età avanzata quando i neuroni sono più vulnerabili ai danni. I geni alla base di questi meccanismi possono essere identificati in mutanti che presentano neurodegenerazione, un indicatore fenotipipico per la perdita di neuroprotezione, utilizzando un protocollo genetico in avanti. Gli schermi genetici in avanti che utilizzano mutageni chimici come il metaesonte etilare (EMS) o N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) sono particolarmente utili a causa delle mutazioni casuali che inducono, con conseguente un approccio intrinsecamente imparziale che ha fatto luce numerose funzioni geniche negli organismi del modello eucariotico3,4,5 (al contrario, la mutagenesi a raggi X crea rotture del DNA e può provocare riarrangiamento piuttosto che mutazioni puntiformi6).
Il comune filo della frutta Drosophila melanogaster è un soggetto ideale per questi schermi grazie alla sua alta qualità, sequenza genomica ben annotata, la sua lunga storia come organismo modello con strumenti genetici altamente sviluppati, e più significativamente, la sua comune storia evolutiva con gli esseri umani7,8. Un fattore limitante nell’applicabilità di questo protocollo è la letalità precoce causata dai geni mutati, che impedirebbe i test ai9anni . Tuttavia, per le mutazioni non letali, un saggio di arrampicata, che sfrutta il geotassi negativo, è un metodo semplice, anche se esteso, per quantificare il funzionamento motorio alterato10. Per mostrare una sufficiente reattività locomotoria, le mosche dipendono dalle funzioni neurali per determinare la direzione, percepire la sua posizione e coordinare il movimento. L’incapacità delle mosche di salire sufficientemente in risposta agli stimoli può quindi indicare difetti neurologici11. Una volta identificato un particolare fenotipo dell’arrampicata difettosa, ulteriori test utilizzando uno schermo secondario come l’analisi istologica del tessuto cerebrale, possono essere utilizzati per identificare la neurodegenerazione nelle mosche difettose dell’arrampicata. La successiva mappatura genica può quindi essere utilizzata per rivelare la regione genomica sul cromosoma che porta il gene neuroprotettivo difettoso di interesse. Per restringere la regione cromosomica di interesse, è possibile eseguire la mappatura meiotica utilizzando linee di mosca mutanti che trasportano geni marcatori dominanti con posizioni note sul cromosoma. I geni marcatori fungono da punto di riferimento per la mutazione, poiché la frequenza di ricombinazione tra due loci fornisce una distanza misurabile che può essere utilizzata per mappare la posizione approssimativa di un gene. Infine, l’attraversamento delle linee mutanti con linee che trasportano carenze equilibrate sulla regione cromosomica meioticamente mappata crea un test di complemento in cui il gene di interesse può essere verificato se il suo fenotipo noto è espresso5. Le sequenze di nucleotidi polimorfici nel gene identificato, eventualmente risultanti in sequenze di amminoacidi alterate, possono essere valutate sequenziando il gene e confrontandolo con la sequenza del genoma della Drosophila. La successiva caratterizzazione del gene di interesse può includere test di ulteriori alleli mutanti, esperimenti di salvataggio delle mutazioni e l’esame di fenotipi aggiuntivi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli schermi genetici in avanti nella Drosophila sono stati un approccio efficace per identificare i geni coinvolti in diversi processi biologici, tra cui la neuroprotezione dipendente dall’età5,23,24, 25. Utilizzando questa strategia, siamo riusciti a identificare il moccioso come un nuovo gene neuroprotettivo17.
Un passaggi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo particolarmente grati al Dr. Barry Ganetzky, in chi è stato eseguito il laboratorio dello schermo genetico, permettendo l’identificazione e la caratterizzazione del marmocchio come gene neuroprotettivo. Ringraziamo il Dr. Steven Robinow per aver gentilmente fornito la raccolta di mosche ENU-mutagenized utilizzati nella schermata genetica presentata in questo articolo. Ringraziamo i membri del laboratorio Ganetzky, i dottori Grace Boekhoff-Falk e David Wassarman per le discussioni utili per tutta la durata di questo progetto, Ling Ling Ho e Bob Kreber per l’assistenza tecnica, il Dr. Aki Ikeda per l’uso della sua struttura microtoma presso il Dell’Università del Wisconsin e il Dr. Kim Lackey e lo Optical Analysis Facility presso l’Università dell’Alabama.
Materials
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is X20 |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1X | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24×60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 | |
Riferimenti
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