ショウジョウバエメラノガスターの新しい神経保護遺伝子を同定する生体内前方遺伝スクリーン
Summary
我々は、ショウジョウバエメラノガスターで神経変性を示す変異体のスクリーニングに前方遺伝的アプローチを用いてプロトコルを提示する。登山アッセイ、血管解析、遺伝子マッピング、DNAシーケンシングを組み込み、最終的に神経保護のプロセスに関連する新しい遺伝子を同定します。
Abstract
神経変性疾患の発症と進行について理解する多くがあります, 責任を負う基礎となる遺伝子を含む.化学変異原を用いた前方遺伝子スクリーニングは、ヒトと保存された細胞経路を共有するショウジョウバエおよび他のモデル生物の間で変異型を遺伝子にマッピングするための有用な戦略である。目的の変異遺伝子がハエの発達初期の段階で致死的でない場合、クライミングアッセイは、低上昇率などの脳機能低下の表現型指標をスクリーニングするために行うことができる。続いて、脳組織の二次組織学的解析は、神経変性型をスコアリングすることにより遺伝子の神経保護機能を検証するために行うことができる。遺伝子マッピング戦略には、これらの同じアッセイに依存するメオティックおよび欠乏マッピングが含まれており、その後にDNAシーケンシングを行い、目的の遺伝子におけるヌクレオチドの変化の可能性を特定することができます。
Introduction
ニューロンは、ほとんどの部分は有人性のポスト・マイトティックのためのものであり、1、2を分割することができません。ほとんどの動物では、神経保護機構は、特にニューロンが損傷に最も脆弱である老年期に、生物の寿命を通じてこれらの細胞を維持するために存在する。これらのメカニズムの基礎となる遺伝子は、神経変性を示す変異体、前方遺伝プロトコルを使用して、神経保護の喪失のための目の前の指標で同定することができる。エチルメタンスルホン酸エチル(EMS)やN-エチル-N-ニトロスア(ENU)などの化学変異を用いた前方遺伝スクリーンは、それらが誘発するランダムな点突然変異のために特に有用であり、本質的に公平なアプローチをもたらし、光を当てた本質的に公平なアプローチをもたらす真核生物モデル生物3,4,5における多数の遺伝子機能(対照的に、X線変異はDNA切断を作成し、点突然変異6ではなく再配列を引き起こす可能性がある)。
一般的なフルーツフライショウジョウバエメラノガスターは、その高品質、よくアノテートゲノム配列、高度に発達した遺伝的ツールを持つモデル生物としての長い歴史、そして最も重要な、その共有のために、これらの画面のための理想的な被験者です人間との進化史7,8.このプロトコルの適用性の制限要因は、変異した遺伝子によって引き起こされる早期致死性であり、これは9歳での試験を妨げるだろう。しかし、非致死的変異の場合、負のジオタキシスを利用する登山アッセイは、単純であるが、広範であるが、運動機能障害を定量化する方法10である。十分な運動反応性を示すために、ハエは方向を決定し、その位置を感知し、動きを調整するために神経機能に依存する。したがって、刺激に応答してハエが十分に上昇することができないことは、神経学的欠陥11を示すことができる。特定の欠陥クライミング表現型が同定されると、脳組織の組織学的分析などの二次スクリーンを用いてさらなる試験を行い、クライミング欠陥ハエにおける神経変性を同定するために使用することができる。その後の遺伝子マッピングは、目的の欠陥のある神経保護遺伝子を運ぶ染色体上のゲノム領域を明らかにするために使用することができる。目的の染色体領域を絞り込むため、染色体上に既知の位置を有する支配的なマーカー遺伝子を運ぶ変異型フライラインを用いたマイオティックマッピングを行うことができる。マーカー遺伝子は、2つの遺伝子座間の組み換えの頻度が遺伝子のおおよその位置をマッピングするために使用できる測定可能な距離を提供するように、突然変異の基準点として機能します。最後に、目的の染色体領域にバランスのとれた欠陥を運ぶ線と変異線を交差させるには、その既知の表現型が発現された場合に目的の遺伝子を検証できる補体試験が作成される。同定された遺伝子における多形性ヌクレオチド配列は、おそらくアミノ酸配列の変化をもたらし、遺伝子をシーケンシングし、それをショウジョウバエのゲノム配列と比較することによって評価することができる。目的の遺伝子のその後の特徴付けは、追加の変異性ア列のテスト、突然変異救助実験および追加の文型の検査を含むことができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ショウジョウバエにおける前方遺伝スクリーンは、加齢依存性神経保護5、23、24、および、異なる生物学的プロセスに関与する遺伝子を同定するための効果的なアプローチであった。25.この戦略を用いて、我々は新しい神経保護遺伝子17としてブラットを同定するこ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、遺伝的スクリーンが行われた研究室で、神経保護遺伝子としてのブラットの同定と特徴付けを可能にしたバリー・ガネツキー博士に特に感謝しています。私たちは、この記事で提示された遺伝的スクリーンで使用されるENU変異ハエのコレクションを親切に提供してくれたスティーブン・ロビナウ博士に感謝します。ガネツキー研究所のメンバー、グレース・ボーコフ・ファルク博士、デビッド・ワッサーマン博士に感謝申し上げます。ウィスコンシン大学、キム・ラッキー博士、アラバマ大学光学分析施設
Materials
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is X20 |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1X | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24×60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 | |
Riferimenti
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