암 연구에서 치료 및 진단 항체 바이오 유통 평가를 위한 생체내 면역형광 국소화
Summary
생체 내 면역형광 국소화(IVIL) 방법은 생체내 종양 표적화 및 ex vivo 면역염색의 조합을 사용하여 살아있는 유기체에서 종양학적 목적을 위해 항체 및 항체 접합체의 생체 분포를 검사하는데 사용될 수 있다. 방법.
Abstract
단일 클론 항체 (mAbs)는 암 검출, 진단 및 치료에 중요한 도구입니다. 그(것)들은 종양 발생에 있는 단백질의 역할을 해명하기 위하여 이용되고, 종양 탐지 및 특성화를 가능하게 하는 암 biomarkers에 지시될 수 있고, 면역 이펙터 세포를 활성화하기 위하여 mAbs 또는 항체 약 접합체로 암 치료에 사용될 수 있고, 억제하기 위하여 신호 경로, 또는 직접 특정 항원을 운반 하는 세포를 죽일. 신규하고 고도로 특이적인 mAbs의 개발 및 생산에 대한 임상적 진보에도 불구하고, 진단 및 치료 응용은 종양 미세 환경의 복잡성과 이질성에 의해 손상될 수 있다. 따라서, 효율적인 항체 기반 치료 및 진단의 개발을 위해, 살아있는 종양 미세 환경과 항체 기반 컨쥬게이트의 생체 분포 및 상호작용을 평가하는 것이 중요하다. 여기에서, 우리는 생체 내 면역형 광형 국소화 (IVIL)를 생체 내 생리및 병리학 적 조건에서 항체 기반 치료제 및 진단의 상호 작용을 연구하는 새로운 접근법으로 설명합니다. 이 기술에서, 치료 적 또는 진단 항원 특이적 항체는 정맥 내 생체 내에서 주입되고 분리된 종양에서 이차 항체를 가진 생체외 로 국소화된다. 따라서 IVIL은 항체 기반 약물 및 표적화제의 생체내 생체 분포를 반영한다. 2개의 IVIL 응용은 유방암의 분자 화상 진찰을 위한 항체 기지를 둔 조영제의 biodistribution 그리고 접근성을 평가하는 기술됩니다. 이 프로토콜은 미래 사용자가 자신의 항체 기반 연구 응용 프로그램에 대한 IVIL 방법을 적응 할 수 있습니다.
Introduction
단클론 항체(mAb)는 B 세포에 의해 분비되는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 큰 당단백질(약 150 kDa)이며, 면역계에서 1차 적인 기능을 가지고 있는 것은 생물학적 기능을 식별하고 억제하거나, 또는 파괴, 세균 또는 바이러스 성 병원체, 암 세포에 비정상적인 단백질 발현을 인식할 수 있습니다1. 항체는 생물 의학2에서매우 유망한 도구를 만드는 펨토몰 농도까지 그들의 특정 에피토프에 매우 높은 친화력을 가질 수 있습니다. 밀스타인과 쾰러 (1984 년 노벨상 수상)에 의해 하이브리드 도마 기술의 개발과 함께, mAbs의 생산이 가능하게되었다3. 이후, 인간 mAb는 파지 디스플레이 기술 또는 형질전환 마우스 균주를 이용하여 생성되었고, 그들의 새로운 연구 도구 및 치료제로서의 사용에혁명을일으켰다4,5.
암은 전 세계적으로 건강 문제이며 예방, 탐지 및 치료에 대한 새로운 접근법의 필요성을 만드는 주요 사망 원인6. 현재까지, mAbs는 종양 발생에 있는 유전자 그리고 그들의 단백질의 역할의 구출을 허용하고 암 biomarkers에 대하여 지시될 때, 환자 계층화를 위한 종양 탐지 그리고 특성화를 가능하게 할 수 있습니다. 암 치료의 경우, 이중특이적 mAbs, 항체-약물 접합체 및 더 작은 항체 단편이 치료제로서 개발되고 있으며, 표적 약물 전달을 위한 치료 효능을 향상시키기 위해7. 추가적으로, 항체는 형광 유도 수술, 광음향 (PA) 화상 진찰, 초음파 (미국) 분자 화상 진찰 및 임상으로 이용된 양전자 방출과 같은 분자 화상 진찰 양식에 대한 조영제의 biomarker 표적화를 위해 봉사합니다 단층 촬영 (PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT)8. 마지막으로, 항체는 또한 표적 치료에 대한 환자의 계층화 및 반응 모니터링을 가능하게 하는 라노스틱 제제로서 사용될 수있다 9. 따라서, 새로운 mAb는 암 탐지, 진단 및 처리에 있는 중요한 역할을 하기 시작됩니다.
신규하고 고도로 구체적인 mAb의 개발 및 생산에 있어 중요한 발전에도 불구하고 종양 환경의 복잡성으로 인해 진단 및 치료 응용 분야는 비효율적일 수 있습니다. 항체 상호작용은 에피토프의 종류에 의존한다,즉,선형 또는형태(10)인지. 항원의 인식 이외에, 항체는 항원을 발현하는 표적 세포에 도달하기 위하여 혈관 벽, 기저 막 및 종양 기질과 같은 자연적인 방벽을 극복할 필요가 있습니다. 항체는 가변 단편 항원 결합(Fab) 도메인을 통해서뿐만 아니라 상수 결정성 단편(Fc)을 통해조직과 상호작용하여 오프사이트상호작용(11)을더욱 유도한다. 표적화는 또한 종양 혈관화 및림프계(12,13)에서종양 벌크 및 이질성을 통하여 종양 마커의 이질적인 발현에 의해 복잡해진다. 또한, 종양 미세 환경은 종양 세포를 지원하는 암 관련 섬유 아세포, 항 종양 면역 반응을 억제하는 종양 면역 세포, 산소 및 영양소의 수송을 지원하는 종양 내피로 구성됩니다. 항체 기반 치료제 또는 진단의 침투, 분배 및 가용성을 방해합니다. 전반적으로, 이러한 고려 사항은 치료 또는 진단 효능을 제한하고, 치료 반응을 감소시키고, 종양 저항성을 초래할 수 있다.
따라서, 효율적인 항체 기반 치료법 및 진단의 개발을 위해, 종양 미세환경 내의 항체 기반 컨쥬게이트의 생체 분포 및 상호작용을 평가하는 것이 중요하다. 현재, 전임상 연구에서, 종양 연구 모델에서마커 발현은 종양섹션(14)의면역형광(IF) 염색에 의해 생체내 생체내를 분석한다. 표준 IF 염색은 동물에게서 분리된 ex vivo 종양 조직 조각에 이차 형광표지된 항체에 의해 그 때 강조되는 1 차적인 마커 특정 항체로 실행됩니다. 이 기술은 조직 고정시의 마커의 정적 위치를 강조하고 항체 기반 치료제 또는 진단이 생리적 조건에서 어떻게 분배하거나 상호 작용할 수 있는지에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다. PET, SPECT, 미국 및 PA에 의한 분자 이미징은 살아있는 전임상 모델8,15에서항체 접합조제 분포에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 이미징 양식은 비침습적이기 때문에, 종방향 연구를 수행할 수 있으며, 시간에 민감한 데이터는 그룹당 최소한의 동물로 수집될 수 있다. 그러나, 이러한 비침습적 분자 이미징 접근법은 충분히 민감하지 않으며 세포 수준에서 항체 분포의 국소화를 위한 충분한 분해능이 없다. 부가적으로, 1차 항체의 물리적 및 생물학적 특성은조영제(16)의컨쥬게이션에 의해 크게 변화될 수 있다.
항체 기반 치료제 및 진단이 종양 환경 내에서 상호 작용하는 방법을 고려하여 생체 내 생리학적 및 병리학적 조건을 취하고 고해상도 세포 및 심지어 하위 세포 분포를 얻기 위해 비 공액 항체의 프로파일, 우리는 항원 특이적 항체가 생체 내에서 정맥 주사되는 생체 내 면역 형광 국소화 (IVIL)로 간주되는 IF 접근법을 제안합니다. 항체 기지를 둔 치료 또는 진단은, 1 차적인 항체로 작용하고, 기능성 혈관에서 순환하고 고도로 정확한 살아있는 종양 환경에서 그것의 표적 단백질에 묶습니다. 생체 내 표지된 종양을 1차 항체와 분리한 후, 이차 항체는 축적되고 유지된 항체 접합체를 국소화하는 데 사용된다. 이 접근법은 형광 표지된 항체17을주입하는 이전에 기술된 IF 진학 접근법과 유사하다. 여기서, 비공액 항체의 사용은 항체 변형에 의해 유도된 생체 분포 특성의 잠재적 변화를 피한다. 더욱이, 형광 이차 항체의 생체 내 적용은 조직 수집 및 처리 동안 형광 신호의 가능한 손실을 방지하고 형광 신호 강도의 증폭을 제공한다. 당사의 라벨링 접근법은 항체 기반 약물 및 표적 제제의 생체 분포를 반영하며 새로운 진단 및 치료제 개발을 위한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
여기에서, 우리는 유방암 검출을 위한 분자 화상 진찰 접근을 위한 항체 기지를 둔 조영제의 biodistribution 그리고 접근성을 조사하는 이전 연구 결과에서 적용된 것과 같이 IVIL 방법의 2개의 응용을 기술합니다. 첫째, 형광 및 광음향 분자를 위한 항체 근적외선 염료 접합체(근적외선 형광 염료, 인도시아닌 그린, B7-H3-ICG)와 이소타입 제어제(Iso-ICG)의 생체 분포 이미징은18. 이 응용 프로그램의 메서드는 프로토콜에 설명되어 있습니다. 다음으로, 네크린-1에 대한 형태적으로 민감한 항체의 생체 분포 결과는, 통상적으로 기존의 IF 이미징으로 검출할 수 없으며, 초음파 분자 이미징과 함께 사용되며, 대표적인 결과19에제시된다. 이 프로토콜 논문의 끝에서, 독자는 자신의 항체 기반 연구 응용 프로그램에 대한 IVIL 방법을 채택 편안하게 느껴야한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 메서드에는 몇 가지 중요한 단계가 있으며 성공적인 구현을 위해 잠재적인 수정이 필요합니다. 첫째, 항체/항체 컨쥬게이트 정맥 주사의 투여량 및 타이밍은 특정 용도에 맞게 조정되어야 한다. 일반적으로, 투여량은 항체 컨쥬게이트가 전형적으로 사용되는 방법, 즉 치료용 항체 또는 항체 기반 조영제의 매칭 투여량과 일치하는 방식과 일치하는 것을 사용되어야 한다. 또한 표적 조직의 수집…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 토론 및 장비 사용을 위한 박사 앤드류 올슨 (스탠포드 신경 과학 현미경 검사법 서비스)에게 감사합니다. 유르겐 케이 윌만 박사님의 멘토링에 감사드립니다. 본 연구는 NIH R21EB022214 교부금(KEW), NIH R25CA118681 교육 보조금(KEW), NIH K99EB023279(KEW)에 의해 지원되었다. 스탠포드 신경 과학 현미경 검사법은 NIH NS069375에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green – NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
Riferimenti
- Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
- McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
- Fleuren, E. D. G., et al. Theranostic applications of antibodies in oncology. Molecular Oncology. 8 (4), 799-812 (2014).
- Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
- Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
- Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
- Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Ricerca sul cancro. 78 (3), 758-768 (2018).
- Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
- Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Ricerca sul cancro. 73, 1689-1698 (2013).
- Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Ryman, J. T., Meibohm, B. Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 6 (9), 576-588 (2017).
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
- Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
- Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).
