O método de localização de imunofluorescência in vivo (IVIL) pode ser usado para examinar a biodistribuição in vivo de anticorpos e conjugados de anticorpo para fins oncológicos em organismos vivos usando uma combinação de segmentação tumoral in vivo e imunocoloração ex vivo Métodos.
Os anticorpos monoclonais (mAbs) são ferramentas importantes na deteção, no diagnóstico, e no tratamento do cancro. São usados para desvendar o papel das proteínas no tumorigenesis, podem ser dirigidos aos biomarcadores do cancro permitindo a deteção e a caracterização do tumor, e podem ser usados para a terapia do cancro como mAbs ou os conjugados da anticorpo-droga para ativar pilhas do efetoras imune, para inibir vias de sinalização, ou matar diretamente as células que transportam o antígeno específico. Apesar dos avanços clínicos no desenvolvimento e na produção de mAbs novos e altamente específicos, as aplicações diagnósticas e terapêuticas podem ser prejudicadas pela complexidade e pela heterogeneidade do microambiente do tumor. Assim, para o desenvolvimento de terapias e diagnósticos eficientes baseados em anticorpos, é crucial avaliar a biodistribuição e a interação do conjugado anticorpo-baseado com o microambiente vivo do tumor. Aqui, nós descrevemos in vivo a localização da imunofluorescência (IVIL) como uma aproximação nova para estudar interações da terapêutica e do diagnóstico anticorpo-baseados nas circunstâncias fisiológicas e patológicas in vivo. Nesta técnica, um anticorpo antígeno-específico terapêutico ou diagnóstico é injetado intravenosamente in vivo e ex vivo localizado com um anticorpo secundário em tumores isolados. O IVIL, portanto, reflete a biodistribuição in vivo de medicamentos à base de anticorpos e agentes de segmentação. Duas aplicações do IVIL são descritas avaliando a biodistribuição e a acessibilidade de agentes de contraste anticorpo-baseados para a imagem latente molecular do cancro da mama. Este protocolo permitirá que os usuários futuros adaptem o método de IVIL para suas próprias aplicações de pesquisa anticorpo-baseadas.
Os anticorpos monoclonais (mAb) são grandes glicoproteínas (aproximadamente 150 kDa) da superfamília da imunoglobulina que são secretadas por pilhas de B e têm uma função preliminar no sistema imune para identificar e para inibir a função biológica de, ou a marca para destruição, bactérias ou agentes patogénicos virais, e pode reconhecer a expressão anormal da proteína em células cancerosas1. Os anticorpos podem ter uma afinidade extremamente elevada a seus resumos específicos para baixo às concentrações do femtomolar que fazem lhes ferramentas altamente prometedores na biomedicina2. Com o desenvolvimento da tecnologia de hibridoma por Milstein e Köhler (premiado com o prêmio Nobel em 1984), a produção de mAbs tornou-se possível3. Mais tarde, os mAbs humanos foram gerados usando a tecnologia de exibição de fago ou cepas de camundongo transgênico e revolucionaram seu uso como novas ferramentas de pesquisa e terapêutica4,5.
O câncer é uma questão de saúde mundial e uma das principais causas de morte, criando a necessidade de novas abordagens para prevenção, detecção e terapia6. Até o momento, os mAbs permitiram o desencarceramento do papel dos genes e de suas proteínas no tumorigênese e quando dirigidos de encontro aos Biomarkers do cancer, podem permitir a deteção e a caracterização do tumor para a estratificação paciente. Para a terapia do cancro, os mAbs anticorpos, os conjugados do anticorpo-droga, e os fragmentos menores do anticorpo estão sendo desenvolvidos como o Therapeutics, e para a entrega alvejada da droga para realçar a eficácia terapêutica7. Adicionalmente, os anticorpos servem para a segmentação do biomarcador de agentes de contraste para as modalidades da imagem latente molecular tais como a cirurgia fluorescência-guiada, a imagem latente fotoacústica (PA), a imagem latente molecular do ultra-som (e.u.), e a emissão clìnica usada do positrão (PET) ou tomografia computadorizada de emissão de fóton único (SPECT)8. Por fim, os anticorpos também podem ser usados como agentes teranosóticos possibilitando a estratificação dos pacientes e o monitoramento da resposta para terapias direcionadas9. Conseqüentemente, os mAbs novos estão começando a jogar um papel crítico na deteção, no diagnóstico, e no tratamento do cancro.
Apesar dos avanços críticos no desenvolvimento e na produção de mAbs novos e altamente específicos, as aplicações diagnósticas e terapêuticas podem ser tornadas ineficazes devido à complexidade do ambiente do tumor. As interações de anticorpos dependem do tipo de epítopo, ou seja, seé linear ou conformacional10. Além do reconhecimento de antígenos, os anticorpos precisam superar barreiras naturais, como paredes de vasos, membranas basais e o estroma tumoral para alcançar células-alvo expressando o antígeno. Os anticorpos interagem com o tecido não somente através do domínio da ligação do antígeno do fragmento variável (FAB) mas também através do fragmento cristalino constante (FC) que conduz mais às interações do fora-local11. A segmentação também é complicada pela expressão heterogênea de marcadores tumorais em todo o volume tumoral e heterogeneidade na vascularização tumoral e no sistema linfático12,13. Além, o microambiente do tumor é compor dos fibroblastos Cancer-associados que apoiam pilhas do tumor, pilhas imunes do tumor que suprimem reações imunes antitumorais, e o endotélio do tumor que suporta o transporte do oxigênio e dos nutrientes, todo que interferem na penetração, distribuição e disponibilidade de terapêuticas ou diagnósticos baseados em anticorpos. Globalmente, essas considerações podem limitar a eficácia terapêutica ou diagnóstica, reduzir a resposta ao tratamento e podem resultar em resistência tumoral.
Conseqüentemente, para o desenvolvimento de terapias e de diagnósticos anticorpo-baseados eficientes, é crucial avaliar a biodistribuição e a interação do conjugado anticorpo-baseado dentro do microambiente do tumor. Atualmente, em estudos pré-clínicos, a expressão de marcadores em modelos de pesquisa tumoral é analisada ex vivo pela coloração da imunofluorescência (IF) das secções tumorais14. A coloração padrão IF é realizada com anticorpos primários específicos de marcadores, que são então destacados por anticorpos secundários com rótulo fluorescentamente em fatias de tecido tumoral ex vivo que foram isoladas do animal. Esta técnica destaca a posição estática do marcador na altura da fixação do tecido e não fornece a introspecção em como a terapêutica ou o diagnóstico anticorpo-baseado podem distribuir ou interagir em circunstâncias fisiológicas. A imagem latente molecular por animal de estimação, SPECT, nós, e PA pode fornecer a informação sobre a distribuição anticorpo-conjugated do agente do contraste em modelos pré-clínicos vivos8,15. Como essas modalidades de imagem são não invasivas, estudos longitudinais podem ser realizados e dados sensíveis ao tempo podem ser coletados com um número mínimo de animais por grupo. Entretanto, estas aproximações moleculars não invasoras da imagem latente não são sensíveis bastante e não têm bastante definição para a localização da distribuição do anticorpo a nível celular. Adicionalmente, as características físicas e biológicas do anticorpo primário podem ser drasticamente alteradas pela conjugação de um agente de contraste16.
A fim de tomar as condições in vivo fisiológicas e patológicas em consideração de como a terapêutica baseada em anticorpos e diagnósticos interagem dentro do ambiente tumoral e para obter alta resolução celular e até mesmo distribuição subcelular perfis de anticorpos não conjugados, propomos uma abordagem IF, considerada in vivo immunofluorescence Localization (IVIL), na qual o anticorpo antígeno-específico é injetado intravenosamente in vivo. O anticorpo-baseado terapêutico ou diagnóstico, agindo como um anticorpo preliminar, circula em vasos sanguíneos funcionais e liga-se a sua proteína do alvo no ambiente altamente exato, vivo do tumor. Após a isolação de tumores in vivo-etiquetados com o anticorpo preliminar, um anticorpo secundário é usado para localizar conjugados acumulados e retidos do anticorpo. Esta aproximação é similar a uma aproximação previamente descrita da histologia de injetar anticorpos cDNAs etiquetados17. Embora aqui, o uso de anticorpos não conjugados evita uma mudança potencial nas características da biodistribuição induzidas pela modificação do anticorpo. Além disso, a aplicação ex vivo do anticorpo secundário fluorescente evita uma perda possível de sinal da fluorescência durante a coleção e o processamento do tecido e fornece a amplificação da intensidade do sinal da fluorescência. Nossa aproximação da rotulagem reflete in vivo a biodistribuição de drogas anticorpo-baseadas e de agentes alvejados e pode fornecer introspecções importantes para o desenvolvimento de agentes diagnósticos e terapêuticos novos.
Aqui, nós descrevemos duas aplicações do método de IVIL como aplicado em estudos precedentes que investigam a biodistribuição e a acessibilidade de agentes de contraste anticorpo-baseados para aproximações moleculares da imagem latente para a deteção do cancro da mama. Em primeiro lugar, a biodistribuição de um conjugado de corante infravermelho próximo (anticorpo anti-B7-H3 vinculado à tintura de fluorescência infravermelha próxima, verde de indocyanina, B7-H3-ICG) e o agente de controle isotipo (ISO-ICG) para fluorescência e fotoacústica molecular a imagem latente é explorada18. O método deste aplicativo é descrito no protocolo. Em seguida, os resultados da biodistribuição de um anticorpo conformacionalmente sensível a netrin-1, tipicamente não detectável com a imagem latente tradicional do se, usado com imagem latente molecular do ultra-som, são quantificados e apresentados nos resultados representativos19. Na conclusão deste papel do protocolo, os leitores devem sentir confortável adotar o método de IVIL para suas próprias aplicações de pesquisa anticorpo-baseadas.
Este método tem várias etapas críticas e requer possíveis modificações para garantir a implementação bem-sucedida. Primeiramente, a dosagem e o sincronismo da injeção intravenosa conjugada do anticorpo/anticorpo devem ser costurados à aplicação específica. Geralmente, as dosagens devem ser usadas que são consistentes com a forma como o conjugado de anticorpos normalmente será usado, ou seja, dosagens de correspondência do anticorpo terapêutico ou agente de contraste baseado em anticorpos. Também, o sin…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Dr. Andrew Olson (serviço de microscopia de neurociência de Stanford) para discussões e uso de equipamentos. Agradecemos ao Dr. Juergen K. willmann pela sua orientação. Este estudo foi apoiado pela concessão de NIH R21EB022214 (KEW), pela concessão do treinamento de NIH R25CA118681 (KEW), e pelo NIH K99EB023279 (KEW). O serviço de microscopia de neurociência de Stanford foi apoiado pela NIH NS069375.
Animal Model | |||
FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
Animal Handling Supplies | |||
27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
Tissue Collection | |||
Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Antibodies | |||
AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
Reagents | |||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
Indocyanine Green – NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Supplies | |||
Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
Software | |||
FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |