In vivo immunofluorescentie lokalisatie voor de beoordeling van therapeutische en diagnostische antilichamen Biodistribution in kankeronderzoek
Summary
De in vivo immunofluorescentie lokalisatie (IVIL)-methode kan worden gebruikt om in vivo biodistributie van antilichamen en antilichaam conjugaten voor oncologische doeleinden in levende organismen te onderzoeken met behulp van een combinatie van in vivo tumor targeting en ex vivo-immunokleuring Methoden.
Abstract
Monoklonale antilichamen (mAbs) zijn belangrijke instrumenten voor de opsporing, diagnose en behandeling van kanker. Ze worden gebruikt om de rol van eiwitten in tumorigenesis ontrafelen, kan worden gericht aan kanker biomarkers waardoor tumor detectie en karakterisering, en kan worden gebruikt voor kankertherapie als mAbs of antilichaam-drug conjugaten te activeren immune Effector cellen, remmen signalering van trajecten, of direct dodencellen die het specifieke antigeen dragen. Ondanks klinische ontwikkelingen in de ontwikkeling en productie van nieuwe en zeer specifieke mAbs, diagnostische en therapeutische toepassingen kunnen worden aangetast door de complexiteit en heterogeniteit van de tumor micro omgeving. Voor de ontwikkeling van efficiënte therapieën en diagnostiek op basis van antilichamen is het dus cruciaal om de biodistributie en interactie van het op antilichamen gebaseerde geconjugeerde met de levende tumor microomgeving te beoordelen. Hier beschrijven we in vivo immunofluorescentie lokalisatie (IVIL) als een nieuwe benadering om interacties van op antilichamen gebaseerde therapieën en diagnostiek in de in vivo fysiologische en pathologische omstandigheden te bestuderen. In deze techniek wordt een therapeutisch of diagnostisch antigeen-specifiek antilichaam intraveneus geïnjecteerd in vivo en gelokaliseerde ex vivo met een secundair antilichaam in geïsoleerde tumoren. IVIL weerspiegelt daarom de in vivo biodistributie van op antilichamen gebaseerde geneesmiddelen en doelstoffen. Twee IVIL-toepassingen worden beschreven bij het beoordelen van de biodistributie en de toegankelijkheid van contrastmiddelen op basis van antilichamen voor moleculaire beeldvorming van borstkanker. Dit protocol stelt toekomstige gebruikers in staat om de IVIL-methode aan te passen voor hun eigen op antilichamen gebaseerde onderzoekstoepassingen.
Introduction
Monoklonale antilichamen (mAb) zijn grote glycoproteïnen (ongeveer 150 kDa) van de immunoglobuline superfamilie die worden uitgescheiden door B-cellen en die een primaire functie in het immuunsysteem hebben om de biologische functie van, of markeren voor vernietiging, bacteriële of virale pathogenen, en kan abnormale eiwit expressie op kankercellen herkennen1. Antilichamen kunnen een extreem hoge affiniteit hebben met hun specifieke epitopen tot en met femtomollaire concentraties, waardoor ze veelbelovend zijn in biogeneeskunde2. Met de ontwikkeling van hybridoma-technologie door Milstein en Köhler (bekroond met de Nobel prijs in 1984), werd de productie van mAbs mogelijk3. Later werden menselijke MABS gegenereerd met behulp van de faag display technologie of transgene muis stammen en revolutioneerden hun gebruik als nieuwe research tools en Therapeutics4,5.
Kanker is een wereldwijd gezondheidsprobleem en een belangrijke doodsoorzaak die de behoefte aan nieuwe benaderingen voor preventie, opsporing en therapie6creëert. Tot nu toe, MABS hebben toegestaan verdrievoudiging van de rol van genen en hun eiwitten in tumorvorming en wanneer gericht tegen kanker biomarkers, kan tumor detectie en karakterisering voor patiënt stratificatie. Voor kankertherapie, bispecifieke mAbs, antilichaam-drug conjugaten, en kleinere antilichaam fragmenten worden ontwikkeld als Therapeutics, en voor de beoogde drug delivery ter verbetering van de therapeutische werkzaamheid7. Daarnaast dienen antilichamen voor de biomarker-targeting van contrastmiddelen voor moleculaire beeldvormings modaliteiten zoals fluorescentie geleide chirurgie, photoacoustic (PA) beeldvorming, echografie (VS) moleculaire beeldvorming en klinisch gebruikte positron-emissie tomografie (PET) of enkelvoudige foton emissie computertomografie (SPECT)8. Tot slot kunnen antilichamen ook worden gebruikt als theranostische middelen die stratificatie van patiënten mogelijk maken en respons monitoring voor gerichte therapieën9. Daarom beginnen nieuwe mAbs een cruciale rol te spelen bij de opsporing, diagnose en behandeling van kanker.
Ondanks kritische vooruitgang in de ontwikkeling en productie van nieuwe en zeer specifieke mAbs, diagnostische en therapeutische toepassingen kunnen worden weergegeven ineffectief als gevolg van de complexiteit van de tumor omgeving. Interacties tussen antilichamen zijn afhankelijk van het type epitope,d.w.z. ofhet lineair of conformationeel10is. Naast de herkenning van antigenen moeten antilichamen natuurlijke barrières overwinnen, zoals de wanden van het vat, basale membranen en de tumor stroma om doelcellen te bereiken die het antigeen uitdrukken. Antilichamen communiceren niet alleen met het weefsel via het variabele fragment antigen binding (FAB) domein, maar ook via het constant kristallijne fragment (FC) dat verder leidt tot off-site interacties11. Targeting wordt ook bemoeilijkt door de heterogene expressie van tumormarkers in de tumor bulk en heterogeniteit in tumor vascularisatie en het lymfestelsel12,13. Bovendien, de tumor micro omgeving is samengesteld uit kanker-geassocieerde fibroblasten die tumorcellen ondersteunen, tumor immune cellen die anti-tumor immuunreacties onderdrukken, en de tumor endotheel die het transport van zuurstof en voedingsstoffen ondersteunt, alle van die interfereren met de penetratie, distributie en beschikbaarheid van op antilichamen gebaseerde therapieën of diagnostiek. Algemene, deze overwegingen kunnen beperken therapeutische of diagnostische werkzaamheid, vermindering van de behandeling reactie, en kan resulteren in tumor resistentie.
Daarom is het voor de ontwikkeling van efficiënte op antilichamen gebaseerde therapieën en diagnostiek cruciaal om de biodistributie en interactie van het op antilichamen gebaseerde geconjugeerde in de tumor micro omgeving te beoordelen. Momenteel, in preklinische studies, marker expressie in tumor Research modellen wordt geanalyseerd ex vivo door immunofluorescentie (indien) kleuring van tumor secties14. Standaard indien kleuring wordt uitgevoerd met primaire marker-specifieke antilichamen die vervolgens worden gemarkeerd door secundaire fluorescently gelabelde antilichamen op ex vivo tumorweefsel segmenten die zijn geïsoleerd van het dier. Deze techniek benadrukt de statische locatie van de marker op het moment van weefsel fixatie en geeft geen inzicht in hoe de op antilichamen gebaseerde therapieën of diagnostiek in fysiologische omstandigheden kunnen verspreiden of ermee omgaan. Moleculaire beeldvorming door Pet, SPECT, US en PA kan informatie verschaffen over de verdeling van antilichamen-geconjugeerde contrast agenten in levende preklinische modellen8,15. Aangezien deze beeldvormings modaliteiten niet-invasief zijn, kunnen longitudinale onderzoeken worden uitgevoerd en kunnen tijdgevoelige gegevens worden verzameld met een minimaal aantal dieren per groep. Deze niet-invasieve moleculaire beeldvormings benaderingen zijn echter niet gevoelig genoeg en hebben onvoldoende resolutie voor de lokalisatie van antilichaam distributie op cellulair niveau. Bovendien kunnen de fysische en biologische kenmerken van het primaire antilichaam drastisch worden gewijzigd door de conjugatie van een contrastmiddel16.
Om de in vivo fysiologische en pathologische omstandigheden rekening te houden met de interactie van op antilichamen gebaseerde therapieën en diagnostiek binnen de tumor omgeving en om cellulaire en zelfs sub-cellulaire distributie met een hoge resolutie te verkrijgen profielen van niet-geconjugeerde antilichamen, stellen wij een IF-benadering voor, die wordt geacht in vivo immunofluorescentie lokalisatie (IVIL), waarbij het antigeen-specifieke antilichaam in vivo intraveneus wordt geïnjecteerd. De op antilichamen gebaseerde therapeutische of diagnostische, optredend als primair antilichaam, circuleert in functionele bloedvaten en bindt zich aan zijn doel proteïne in de uiterst nauwkeurige, levende tumor omgeving. Na isolatie van in vivo-gelabelde tumoren met het primaire antilichaam, wordt een secundair antilichaam gebruikt om geaccumuleerde en bewaarde antilichaam conjugaten te lokaliseren. Deze benadering is vergelijkbaar met een eerder beschreven als histologie benadering die fluorescently gelabelde antilichamen17injecteert. Hoewel hier, het gebruik van niet-geconjugeerde antilichamen vermijdt een mogelijke verandering in bioverdelings kenmerken veroorzaakt door modificatie van antilichamen. Bovendien vermijdt ex vivo toepassing van fluorescerende secundair antilichaam een mogelijk verlies van fluorescentie signaal tijdens het verzamelen en verwerken van weefsels en biedt versterking van de intensiteit van het fluorescentie signaal. Onze etiketterings aanpak weerspiegelt in vivo biodistributie van op antilichamen gebaseerde geneesmiddelen en doelstoffen en kan belangrijke inzichten bieden voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische en therapeutische middelen.
Hier beschrijven we twee toepassingen van de IVIL-methode zoals toegepast in eerdere studies die de biodistributie onderzoeken en de toegankelijkheid van antilichamen-gebaseerde contrastmiddelen voor moleculaire beeldvormings benaderingen voor borstkanker detectie. Ten eerste is de biodistributie van een antilichaam-near infrarood kleur conjugaat (anti-B7-H3-antilichaam gebonden aan de Near Infrared fluorescentie Dye, indocyanine Green, B7-H3-ICG) en het Isotype-controlemiddel (ISO-ICG) voor fluorescentie en fotoakoestisch moleculair beeldvorming is verkend18. De methode van deze toepassing wordt beschreven in het protocol. Vervolgens wordt de bioverdelings resultaten van een conformatief gevoelig antilichaam tegen netrin-1, meestal niet detecteerbaar met traditionele als beeldvorming, gebruikt met echografie moleculaire beeldvorming, gekwantificeerd en gepresenteerd in de representatieve resultaten19. Aan het einde van dit protocol papier moeten lezers zich comfortabel voelen bij het aannemen van de IVIL-methode voor hun eigen op antilichamen gebaseerde onderzoekstoepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode heeft verschillende kritieke stappen en vereist mogelijke wijzigingen om te zorgen voor een geslaagde implementatie. Ten eerste moet de dosering en timing van de intraveneuze injectie van antilichaam/antilichaam conjugaat worden afgestemd op de specifieke toepassing. In het algemeen moeten doseringen worden gebruikt die consistent zijn met hoe het antilichaam conjugaat meestal zal worden gebruikt, d.w.z. overeenkomende doseringen van het therapeutische antilichaam of contrastmiddel op basis van antilichamen….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy service) voor discussies en het gebruik van apparatuur. We danken Dr. Juergen K. Willmann voor zijn mentorschap. Deze studie werd ondersteund door NIH R21EB022214 Grant (KEW), NIH R25CA118681 training Grant (KEW) en NIH K99EB023279 (KEW). De Stanford Neuroscience microscopie service werd ondersteund door NIH NS069375.
Materials
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green – NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
Riferimenti
- Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
- McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
- Fleuren, E. D. G., et al. Theranostic applications of antibodies in oncology. Molecular Oncology. 8 (4), 799-812 (2014).
- Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
- Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
- Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
- Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Ricerca sul cancro. 78 (3), 758-768 (2018).
- Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
- Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Ricerca sul cancro. 73, 1689-1698 (2013).
- Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Ryman, J. T., Meibohm, B. Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 6 (9), 576-588 (2017).
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
- Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
- Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).
